Текст книги "Респираторная медицина. Руководство (в 2-х томах)"

meta:

author:

fio[ru]: М.Н. Зубков

codes:

next:

type: dklinrek

code: II.I

type: dkli00023

ВВЕДЕНИЕ

Эволюция представлений о разнообразии этиологической структуры инфекций нижних дыхательных путей (ИНДП) происходит параллельно с совершенствованием методов выявления микробных возбудителей и их маркеров, появлением новых технологий, основанных на молекулярно-биологических подходах к этиологической диагностике бронхолегочных инфекций. В настоящее время описано более 100 микроорганизмов, способных вызывать ИНДП, почти все они были хотя бы однократно обнаружены при биопсии легочной ткани (рис. 5-7).

path: pictures/0507.png

Рис. 5-7. Этиологические агенты при ИНДП.

* ТОРС – тяжелый острый респираторный синдром

Сложность проведения микробиологической диагностики легочных заболеваний, связана со следующими особенностями:

– широкое разнообразие инфекционных агентов, относящихся к разным классам микроорганизмов, что определяет широкий перечень биологических материалов и методов их исследования;

– секрет, получаемый из нижних отделов дыхательного тракта, контаминируется микрофлорой верхних дыхательных путей (ВДП) и ротовой полости, представленной аэробными, анаэробными бактериями и грибами в концентрациях 10¹⁰ – 10¹² КОЕ/мл;

– грамотрицательная флора ( Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Acinetobacter) в ротоглотке встречается в незначительном объеме. Однако у пациентов, ранее получавших антибиотики или страдающих хроническим алкоголизмом, сахарным диабетом, острой лейкемией, концентрация возбудителей грамотрицательной флоры достигает 10⁷ КОЕ/мл. Такая концентрация возбудителей создает предпосылки для развития ИНДП, так как даже незначительная аспирация секрета ротоглотки (в объеме от 0,1 до 1 мл) приводит к попаданию 10⁴ КОЕ/мл в трахеобронхиальное дерево;

– микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae или Staphylococcus aureus, колонизирующие мокроту, маскируют диагностику пневмококковой пневмонии, плевропневмонии анаэробной этиологии и туберкулеза легких;

– предшествующая антибактериальная терапия искажает первичную этиологическую природу инфекционного процесса.

Пациентам с внебольничными пневмониями (ВП) и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), лечение проводят в амбулаторных условиях, рутинные микробиологические исследования нежелательны. Только при неэффективности стартовой эмпирической антимикробной терапии показано бактериологическое исследование мокроты. Серодиагностика может понадобиться в период эпидемий (например, легионеллеза, микоплазменной инфекции), или по особым клиническим и эпидемиологическим причинам.

Набор исследований, проводимый госпитализированным пациентам, определяется тяжестью заболевания, наличием эпидемиологических факторов риска, неэффективностью проводимой эмпирической терапии.

type: dkli00086

ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Исследуют мокроту, промывные воды бронхов, транстрахеальный аспират, бронхиальный (БС) и бронхоальвеолярный смыв (БАС), браш-биоптаты, плевральный экссудат, пунктат инфильтрата или абсцесса легкого, биоптат легочной ткани, кровь на гемокультуру, сыворотку крови для определения специфических антител, мочу для определения легионеллезного и пневмококкового антигенов, мазки из носа, зева и смывы из ротоглотки при диагностике вирусных инфекций. Результативность исследования возрастает при изучении БС и БАС, полученных инвазивными методами. Мокрота – наиболее доступный для анализа материал, но по надежности результатов уступает инвазивным методам, так как в большей степени подвержена контаминации микрофлорой ВДП и ротоглотки.

МОКРОТА

Для исследования у больных собирают утреннюю порцию мокроты натощак в объеме 3 – 5 мл в стерильные флаконы с плотно завинчивающейся крышкой. Желательно предварительно почистить зубы и прополоскать рот кипяченой водой или раствором натрия гидрокарбоната (1 чайная ложка на стакан воды). Если пациент плохо выделяет мокроту, или откашливает ее эпизодически и в скудном объеме, то накануне вечером и рано утром в день сбора мокроты ему следует дать отхаркивающее средство. При подозрении на туберкулез, пневмоцистную и легионеллезную пневмонию необходимо применять раздражающие аэрозольные ингаляции [1, 2] путем вдыхания в течение 10 – 15 мин 30 – 60 мл подогретого до 42 – 45 ⁰;С раствора, приготовленного на стерильной дистиллированной воде, содержащего 150 г/л натрия хлорида и 10 г/л натрия бикарбоната. Получаемая индуцированная мокрота по качеству идентична откашливаемой мокроте [3].

Для диагностики острой бактериальной инфекции достаточно одного образца мокроты, при исследовании на туберкулез или грибковую инфекцию собирают утреннюю мокроту 3 дня подряд, при этом не желательно накапливать ее объем свыше 12 ч из-за чрезмерной контаминации посторонней бактериальной флорой.

Сроки доставки мокроты в лабораторию не должны превышать 1,5 – 2 ч от момента ее получения (допускается хранение в холодильнике, но не более 6 ч), так как задержка ведет к аутолизу S treptococcus pneumoniae, за счет размножения бактерий-контаминантов меняется истинное соотношение микрофлоры бронхиального секрета.

Перед посевом мокроту промывают в стерильном физиологическом растворе, готовят мазки для микроскопии, разжижают муколитиками или гомогенизируют в асептических условиях в ступке со стерильным песком, производят десятикратные серийные разведения в бульоне, из которых делают дозированные высевы на питательные среды с последующей количественной оценкой каждого типа колоний выросших микроорганизмов.

Образцы, отправляемые в референсную лабораторию для посева на микобактерию туберкулеза, перевозят в охлажденном состоянии или их необходимо изначально обработать натрия хлоридом во флаконах или пробирках с плотно завинчивающимися крышками, которые затем помещают в металлический сосуд со стенками из адсорбирующего материала и упаковывают в предназначенный для транспортировки контейнер. Образцы для вирусного культивирования должны быть охлажденными, но не замороженными, в то время как для культивирования на хламидии образцы для транспортировки помещают в сахарозо-фосфатную среду и замораживают.

При исследовании на микобактерии туберкулеза для разжижения мокроты перед посевом ее обрабатывают муколитиком (например, ацетилцистеином в течение 24 – 48 ч) и проводят деконтаминацию 2% раствором каустической соды по Ганеману (не более 15 мин) от посторонних бактерий. После разжижения и деконтаминации образцы центрифугируют (3800 оборотов в минуту), осадок микроскопируют и производят посев. Перед посевом на легионеллы следует использовать муколитики для разжижения мокроты.

ПРОМЫВНЫЕ ВОДЫ БРОНХОВ

Пациенту во время вдоха специальным шприцем в трахею вводят 7 – 10 мл стерильного изотонического раствора, вызывающего кашлевой рефлекс. При этом больной откашливает секрет из глубоких отделов бронхиального дерева, его собирают в стерильный флакон и немедленно отправляют в лабораторию. БС, в том числе вблизи очага воспаления, могут быть сделаны с помощью бронхоскопа. Пациентам с выраженным глоточным рефлексом указанную процедуру проводят после предварительной анестезии надгортанника, гортани и задней стенки глотки. Недостаток – значительное разведение трахеобронхиального содержимого, что снижает возможность выделения бактерий, а концентрация их падает примерно в 100 раз по сравнению с мокротой.

ТРАНСТРАХЕАЛЬНЫЙ АСПИРАТ

Аспират из трахеи и дренирующих бронхов, в том числе вблизи очага воспаления легочной ткани, получают с помощью бронхоскопа. Следует помнить, что при введении бронхоскопа происходит контаминация секрета нижних отделов дыхательного тракта флорой ротоглотки, это искажает истинные результаты. В отличие от мокроты ТТА можно исследовать на анаэробы.

БРОНХОАЛЬВЕОЛЯРНЫЙ СМЫВ

Бронхоальвеолярный смыв (БАС), при котором проводят промывание сегмента легких стерильным изотоническим раствором, имеет наибольшее значение при постановке диагноза пневмонии, вызванной микобактериями [4], Pneumocystis jiroveci у пациентов со СПИДом (диагностическая эффективность достигает 89 – 98%) [5], также цитомегаловирусом (ЦМВ) у пациентов с иммунодефицитом или после трансплантации органов [6, 7]. Бронхоальвеолярный смыв можно использовать для культуральной диагностики легионеллезной, хламидийной и вирусной инфекций и для изучения с помощью молекулярных методов. Вследствие контаминации материала микрофлорой ротоглотки применение бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) в иных клинических ситуациях требует обязательного использования цитологических и количественных критериев его оценки [8]. Наличие менее 1% эпителиальных клеток указывает на отсутствие контаминации орофарингеальной микрофлорой, количественное определение >10⁴ КОЕ/мл при культуральном исследовании свидетельствует о клинической значимости выделенного микроорганизма. Дополнительно можно готовить окрашенные мазки из осадка после центрифугирования жидкости для выявления бактерий, микобактерий туберкулеза, легионелл и грибов, у больных с иммунодефицитом – пневмоцист. Чувствительность и специфичность метода БАЛ при этиологической диагностике ИНДП широко варьируют и в среднем составляют, соответственно, 69±22 и 88±14%.

БРАШ-БИОПТАТ

Материал получают из бронхов специальной канюлей с защищенными щетками (ЗЩ) с помощью фиброоптического бронхоскопа. Принцип метода состоит в использовании системы выдвижных каналов, предохраняющих материал от контаминации микрофлорой ротоглотки при введении и удалении бронхоскопа из нижних отделов дыхательного тракта, это позволяет производить исследования на анаэробы. Браш-биоптат заливают 1 мл стерильного солевого раствора или натрия лактата раствора сложного (раствора Рингера лактата) в асептических условиях и доставляют в лабораторию. Поскольку нельзя полностью исключить контаминацию орофарингеальной микрофлорой, при культуральном исследовании образца используется количественный диагностический критерий >10³ КОЕ/мл.

В различных исследованиях, чувствительность метода ЗЩ варьировала от 22 до 100% [12, 14].

ПЛЕВРАЛЬНАЯ ЖИДКОСТЬ

Перед пункцией плевральной полости кожу обрабатывают 70% этиловым спиртом, затем 1 – 2% раствором йода, который после завершения процедуры удаляют 70% этиловым спиртом для предотвращения ожога кожи. После прокола плевральную жидкость (ПЖ) собирают стерильным шприцем и помещают в анаэробную транспортную систему или отправляют ее в шприце, предварительно сняв (или загнув) иглу и надев на канюлю шприца защитный стерильный колпачок. Минимальный объем ПЖ, необходимый для выделения бактерий, 1 – 5 мл, грибов или микобактерий – не менее 10 мл. Избыток ПЖ или гной транспортируют в стерильных флаконах с плотно завинчивающейся крышкой. При большом количестве материала производят посев в аэробные и анаэробные флаконы со средой для гемокультур в объемном соотношении 1:3 – 1:10. Однако смешанные культуры в бульонной среде растут неодинаково, и появление быстрорастущих бактерий может маскировать микробы с замедленным ростом. Кроме того, становится невозможной прямая бактериоскопия ПЖ и сроки идентификации бульонных культур удлиняют на сутки в сравнении с изолятами, выделенными при первичных посевах на плотные среды.

Взятие ПЖ тампоном не предохраняет анаэробы от воздействия кислорода воздуха, не позволяет приготовить качественный препарат для микроскопии, не гарантирует выделение культуры при незначительном количестве микробов в образце. Нежелательно применять антикоагулянты (натрия цитрат), подавляющие рост некоторых видов бактерий, при необходимости лучше использовать гепарин.

ПУНКТАТ ИНФИЛЬТРАТА ИЛИ АБСЦЕССА ЛЕГКОГО

Образцы получают при трансторакальной пункции под рентгенологическим контролем. Материал из абсцесса включает не только гной, но и ткань капсулы, отграничивающей абсцесс. Гной собирают шприцем, в котором его доставляют в лабораторию, либо содержимое переносят в анаэробные системы для транспортировки. Использование тампонов для взятия гноя на анаэробное исследование запрещено.

БИОПТАТ ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИ

Трансбронхиальная и открытая биопсия легкого – наиболее агрессивные инвазивные методы, применение которых необходимо для диагностики оппортунистических инфекций у больных с иммунодефицитами. В результате появления результативных бронхоскопических методов БАЛ и ЗЩ к инвазивным методам стали прибегать значительно реже.

Открытая биопсия легкого позволяет получить необходимый объем ткани для гистологического и микробиологического исследований. Свежесрезанную поверхность используют для приготовления мазков-отпечатков с последующей окраской на легионеллы, пневмоцисты и грибы. Около 1/3 или 1/2 части образца размельчают в асептических условиях в ступке с абразивным веществом с помощью пестика, либо в механическом гомогенизаторе. Размельченную суспензию или гомогенизированный экстракт используют для посева на легионеллы. Экстракт центрифугируют, из осадка готовят окрашенные мазки для выявления пневмоцист. Этот способ более чувствительный для выявления цист P . jirovecii по сравнению с мазками-отпечатками или гистологическими препаратами целого легкого. Оставшуюся часть образца размельчают (или гомогенизируют) для последующего микроскопического изучения и культурального исследования суспензии (или экстракта) на бактерии, грибы, вирусы, микоплазмы, хламидии. Гомогенат также можно использовать для изучения молекулярно-генетическими методами.

КРОВЬ НА ГЕМОКУЛЬТУРУ

Кровь на гемокультуру целесообразно исследовать в первые 3 – 4 дня от начала заболевания, когда можно выделить гемокультуры при острой бактериальной пневмонии в 3 – 37% наблюдений [3]. Необходим посев крови, взятой при двух раздельных венопункциях с интервалом в 30 – 40 мин, это снижает частоту ложноположительных результатов за счет бактерий-контаминантов кожи на 70%. Если в предшествующие 1 – 2 нед больному проводилась антимикробная терапия, кровь на посев берут 2 – 3 раза в сутки в течение 3 дней. Не следует собирать кровь из внутрисосудистых катетеров, кроме случаев, когда предполагают сепсис катетерного происхождения.

Кожу над пунктируемой веной тщательно обрабатывают 70% этиловым спиртом, затем 1 – 2% настойкой йода в течение 30 с (обработку кожи начинают от центра будущего прокола по направлению к периферии). Дают высохнуть обработанному участку кожи, затем производят венопункцию, после чего вновь обрабатывают участок 70% этиловым спиртом для удаления избытка йода, во избежание раздражения кожи.

Посев осуществляют во флаконы с питательными средами для аэробного и анаэробного культивирования. Перед использованием флаконов визуально определяют прозрачность среды: любое помутнение свидетельствует о ее непригодности. Флаконы хранят в холодильнике, перед использованием (за 30 – 60 мин) – при комнатной температуре. Оптимальный объем крови для исследования у взрослых составляет 20 – 30 мл, соотношение крови и жидкой питательной среды должно быть 1:5 – 1:10.

При отсутствии флаконов для гемокультур используют 20 мл шприц. В шприц предварительно набирают 0,5 – 0,7 мл стерильного гепарина, заменяют иглу и затем пунктируют вену. Набирают 10 мл крови (для дополнительного исследования на анаэробы – 15 мл), перемешивают ее с гепарином осторожным покачиванием шприца (иглу с него не снимают) и в этом же шприце с согнутой у основания иглой немедленно отправляют в лабораторию. Посевы крови инкубируют не менее 7 дней и ежедневно контролируют наличие роста.

МОЧА

Пневмококки в моче можно выявить у 38% больных при пневмококковой пневмонии [16]. Для посева исследуют утреннюю среднюю порцию свободно выпущенной мочи в объеме 3 – 5 мл, используя стерильные емкости. Во избежание излишней ее контаминации при мочеиспускании нормальной микрофлорой нижних отделов мочевыводящего и урогенитального тракта необходимо произвести тщательный туалет наружных половых органов с мылом и кипяченой водой. Посев мочи следует проводить не позднее 2 ч после взятия материала либо в течение 8 ч при условии ее хранения в холодильнике. Необходимо помнить, что при температуре +40 ⁰;С число бактерий в моче обычно остается стабильным в пределах 24 ч. Нежелательно исследовать мочу, полученную катетером. При наличии постоянного катетера протирают его наружное отверстие 70% спиртом, затем шприцем с иглой через отверстие собирают мочу и переносят ее в стерильную емкость (собирать мочу из мешка нельзя!).

При проведении скрининговых исследований на микобактерию туберкулеза мочу (в объеме не менее 20 мл) исследуют 3 дня подряд. Для проведения вирусологических исследований (на аденовирусы, ЦМВ) мочу в замороженном виде в объеме 10 – 15 мл незамедлительно доставляют в лабораторию.

Мочу также исследуют на наличие пневмококкового и легионеллезного антигенов.

МАЗКИ ИЗ НОСА, ЗЕВА И СМЫВЫ ИЗ РОТОГЛОТКИ

Образцы используют для выявления многих респираторных вирусов. Мазки из зева исследуют на наличие Chlamydia pneumoniae , Mycoplasma pneumoniae , Legionella spp. методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

СЫВОРОТКА КРОВИ

Образцы сыворотки крови изучают с помощью серологических методов в острый период инфекции и у реконвалесцентов для диагностики пневмоний, вызванных Legionella pneumophila, C hamydia pneumoniae, Chlam ydia psittaci, M ycoplasma pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, вирусами и грибами.

type: dkli00087

ПРЯМЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ОБРАЗЦОВ

МЕТОДЫ МИКРОСКОПИИ

Микроскопический метод изучения нативных и окрашенных препаратов, в том числе с использованием меченных флюорохромом специфических антисывороток (антительные диагностикумы), обеспечивает быструю предварительную или окончательную диагностику ИНДП и позволяет судить об адекватности материала (в первую очередь мокроты).

При исследовании мокроты начальный этап – отбор гнойных или опалесцирующих участков и перенос их в стерильную чашку Петри. Интересующая часть образца используется для приготовления влажного или окрашенного по Граму мазка для микроскопии. Дифференциацию слущенных эпителиальных клеток (СЭК), реснитчатых эпителиальных клеток, альвеолярных макрофагов и гистиоцитов проводят под малым увеличением микроскопа (объектив x10). Присутствие большого числа СЭК (>25 в поле зрения) свидетельствует о контаминации микрофлорой ротоглотки. Такой образец не пригоден для посева, и материал следует взять повторно. Преобладание в образце полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ), клеток реснитчатого эпителия или альвеолярных макрофагов при отсутствии или незначительном числе СЭК (<10 в поле зрения) свидетельствует о наличии секрета из нижних отделов дыхательного тракта, который подлежит дальнейшему исследованию с помощью иммерсионного объектива при увеличении в 1000 раз и посеву. Диагностический критерий качества мокроты – наличие не менее 25 ПЯЛ и менее 10 СЭК при исследовании в 10 полях зрения под малым увеличением микроскопа (объектив x10). Цитологическая оценка пригодности мокроты важна для бактериального исследования, но не для культуральной индикации МБТ, грибов и вирусов, где перед культивированием производится деконтаминация образцов, используются селективные среды, а обнаружение МБТ, патогенных грибов или вирусных изолятов не вызывает сомнения в их клинической значимости [2].

Под большим увеличением (иммерсионный объектив x100) изучают морфологию бактерий. Чувствительность микроскопического метода при окраске по Граму по разным оценкам варьирует от 35 до 96%, а специфичность – от 12 до 85% [17]. Его диагностическое значение, в основном, ограничивается пневмококковой инфекцией, где совпадение с результатами культуральной диагностики составляет 75% [18].

Эффективность метода для выявления других патогенов у взрослых проблематична. Например, Haemophilus influenzae можно обнаружить в ВДП у здоровых индивидуумов, но гемокультура, как дополнительный диагностический критерий в пользу микроскопического исследования, выделяется редко. Определение в моче антигенов H. influenzae типа В имеет значение в педиатрической практике, но антигенурия может быть следствием вакцинации. У взрослых лишь получение БС инвазивными методами помогает в установлении диагноза. При пневмониях, вызванных H. influenzae, высокую диагностическую ценность имеет исследование ТТА и БАС [19]. Присутствие в образцах большого числа плеоморфных тонких коккобацилл, часто внутри ПЯЛ, достоверно свидетельствует в пользу пневмонии, обусловленной гемофильной палочкой.

Среди других возможных возбудителей ИНДП Moraxella catarrhalis – комменсал ВДП, а носительство Neisseria meningitidis в ротоглотке может варьировать от 10% у взрослого населения до 70% у военнослужащих в закрытых воинских коллективах. Обнаружение в мокроте или ТТА большого числа грамотрицательных диплококков, локализованных внутри и вне ПЯЛ, с высокой вероятностью свидетельствует о возможном участии в этиологии пневмонии морфологически сходных между собой M. catarrhalis или Neisseria spp. [20], что позволяет определить направление дальнейшего культурального исследования.

Проблемы при дифференциации между колонизацией и суперинфекцией возникают с бактериями кишечной группы и псевдомонадами. Обычно грамотрицательные палочки, вызывающие вторичную инфекцию, определяются в значительном числе в мазках мокроты и в ТТА наряду с ПЯЛ, достигая при посеве концентраций 10⁷ – 10¹⁰ КОЕ/мл. Однако и у пациентов ОИТ, находящихся на ИВЛ, в дыхательном секрете можно обнаружить до 10⁸ КОЕ/мл без признаков пневмонии [23].

Таким образом, окраска мазков по Граму – важный и необходимый этап исследования мокроты для определения ее пригодности к культуральному исследованию и позволяет быстро обнаружить вероятные бактериальные возбудители пневмонии. Неправильное приготовление мазков и неграмотная интерпретация результатов окраски существенно снижает ценность метода. Изучение ТТА отличается более высокой специфичностью и чувствительностью при индикации микроорганизмов, включая возбудителей анаэробной инфекции.

Для выявления Mycobacterium tuberculosis микроскопические методы при окраске мазков по Цилю – Нильсену и флюоресцентным красителем имеют одинаковую чувствительность (до 50%) и специфичность (до 99%) [24], совпадение результатов микроскопической и культуральной диагностики зависит от тяжести заболевания. Для обнаружения МБТ в световом микроскопе при окраске по Циль – Нильсену необходимо содержание в мокроте не менее 5000 – 10 000 КОЕ/мл. При окраске мазка аурамин-родамином микроскопия становится более продуктивной в рутинных исследованиях, так как за равный промежуток времени в люминесцентном микроскопе при малом увеличении (объектив x25) можно просмотреть больше полей зрения, чем в световом микроскопе под иммерсией (объектив x90).

При диагностике актиномикоза легких материалом для микроскопического исследования служат гной, мокрота, плевральная жидкость, пунктаты закрытых очагов поражения, биопсийный материал. Наиболее подходящие для исследования – твердые зернистые образования, из которых сначала готовят неокрашенные препараты в капле 10% щелочи или смеси спирта с глицерином, затем мазки, окрашенные по Граму и Цилю – Нильсену. Уже при малом увеличении микроскопа видны комочки (друзы) с плотным, темным центром, с лучистыми образованиями по периферии, которые в дальнейшем изучают под большим увеличением микроскопа. Обнаружение друз, мицелия, отдельных веточек и цепочек из спор – ценное подтверждение актиномикотической природы болезни.

Прямая фазово-контрастная микроскопия бронхиального секрета, со смесью 10% раствора калия гидроксида и 10% глицерина, позволяет проводить быструю идентификацию грибов Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans и Aspergillus spp., добавление специальных красителей позволяет улучшить очертания элементов гриба, включая P. jiroveci.

Для обнаружения L egionella pneumophila непосредственно в мокроте, ТТА, БС, биоптатах ткани легкого применяется реакция прямой иммунофлюоресценции (РИФ), чувствительность которой составляет 25 – 66%, специфичность достигает 94% [25]. Для постановки диагноза легионеллезной пневмонии положительный результат РИФ требуется подтвердить любым другим методом: культуральным исследованием респираторных образцов, либо определением антигена в моче, либо серологическими реакциями с сывороткой крови больного.

Для определения антигенов P. jiroveci в индуцированной мокроте и БАС можно использовать РИФ с моноклональными антителами. Преимущество метода – высокая чувствительность (90 – 97%) и быстрое получение результатов, недостатком – техническая сложность исполнения [26].

РИФ позволяет диагностировать инфекции, вызванные респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ), вирусами гриппа А и В, парагриппа, аденовирусами, вирусом кори, что особенно важно в случаях, когда обычная вирусологическая технология трудоемка или недоступна.

МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ

Определение антигенов широко используется для диагностики различных инфекций, что связано с возможностью быстрого получения результатов и идентификации некультивируемых возбудителей. Однако применительно к ИНДП эти методы имеют ряд существенных ограничений. Во-первых, их чувствительность и специфичность, слишком низкие для рутинного использования. Во-вторых, надежность теста в большей степени зависит от того, может ли возбудитель быть комменсалом (как в случае с Streptococcus pneumoniae) или его наличие всегда свидетельствует об инфекции (например, L egionella pneumophila). В-третьих, данные тесты – достаточно дорогие и требуют существенных временных затрат по сравнению с классическими методами [27, 28].

Для индикации антигенов Streptococcus pneumoniae в мокроте, сыворотке крови и моче были разработаны методы встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ), ко-агглютинации, латекс-агглютинации, иммуноферментного анализа (ИФА). Их чувствительность варьировала от 40 до 90% [29, 30]. Высокая стоимость наборов на выявление пневмококковых антигенов в мокроте и отсутствие исследований, доказывающих влияние антигенов на исход терапии у пациентов, существенно ограничивают возможность их рутинного использования для диагностики пневмоний. Лишь иммунохроматографический тест для выявления пневмококкового антигена в моче в течение 15 мин рекомендован в качестве дополнительного метода диагностики пневмококковой пневмонии, чувствительность которого составляет 86% и специфичность – 94%. Следует помнить о возможности ложноположительных результатов в популяциях с высоким уровнем назофарингеального носительства пневмококков (организованные детские коллективы).

При гемофильной инфекции методы выявления антигена разработаны только для H. influenzae типа B редко вызывающей пневмонии у взрослых, поэтому в рутинной практике они не используются.

При диагностике легионеллезной пневмонии рекомендованы ИФА и радиоиммунологический метод для выявления в моче антигенов L. pneumophila серогруппы 1, на долю которой приходится 70 – 90% всех наблюдений болезни легионеров. Их чувствительность достигает 80 – 99 и 99%, специфичность – 99 и 100%, соответственно [31]. Разработан иммунохроматографический тест для определения легионеллезного антигена в моче.

Существуют наборы для выявления антигенов C. pneumoniae в респираторных образцах, но ввиду перекрестного реагирования с антигенами C. psittaci, они не могут быть рекомендованы к рутинному использованию.

При криптококкозе определяют наличие антигена C ryptococcus neoformans в БАС, плевральном экссудате, сыворотке крови и ликворе [32], а при аспергиллезе используют ИФА для выявления в сыворотке крови белкового антигена (галактоманнана), превалирующего в клеточной стенке Aspergillus spp. [33]. При легочном бластомикозе в сыворотке крови, моче и БАС можно выявить антиген Blastomyces dermatidis у 70 – 100% больных в зависимости от формы инфекции (локализованная или генерализованная) [34].

В назофарингеальном аспирате, лаважной жидкости и мокроте в инфицированных эпителиальных клетках с помощью РИФ и ИФА можно быстро обнаружить антигены вирусов гриппа, парагриппа, аденовирусов, ЦМВ в ранние сроки заболевания.

type: dkli00088

КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

Культивирование образцов из респираторного тракта проводится для выделения и идентификации этиологических агентов и для определения их чувствительности к антибактериальным препаратам. Результативность и специфичность бактериологической диагностики во многом зависит от выбора адекватных питательных сред, условий культивирования микроорганизмов и правильной их идентификации. Существенное значение имеет цитологический скрининг образцов при их отборе для посева, использование результатов окраски по Граму для выбора направления при определении микробных изолятов.

Мокроту засевают на питательные среды, если она удовлетворяет цитологическим критериям. В большинстве случаев для первичного посева достаточно использовать чашки с кровяным агаром, обеспечивающим рост неприхотливых микроорганизмов и S . pneumoniae, и с шоколадным агаром для культивирования H . influenzae и ряда других прихотливых бактерий. Мокроту не сеют в бульон или в анаэробных условиях, чашки инкубируют в атмосфере 5% СО₂ для улучшения роста пневмококков.

При пневмококковой пневмонии из мокроты можно выделить S . pneumoniae в концентрации свыше 10⁷ КОЕ/мл [35]. Основной тест, позволяющий дифференцировать пневмококк от сходных с ним по характеру гемолиза эритроцитов на кровяном агаре зеленящих стрептококков, – его чувствительность к оптохину. Однако растет число штаммов S . pneumoniae с приобретенной резистентностью к оптохину [36]. Альтернативными тестами служат чувствительность к солям желчных кислот и латекс-агглютинация с поливалентной пневмококковой антисывороткой, но эти тесты не всегда дают однозначные результаты. Точная идентификация таких изолятов возможна только с помощью малодоступного метода ПЦР. Эта проблема пока не достигла угрожающих размеров, но отмечаемое во всем мире снижение частоты пневмококковой инфекции, вероятно, связано не только с изменением ее эпидемиологии, но и с возрастающими трудностями индикации S . pneumoniae .

Селективные обогащенные среды используют, если при микроскопическом исследовании в мазках превалируют расположенные внутри и вне клетки грамотрицательные диплококки (применяют модифицированную среду Thayer – Martin) или когда предполагается легионеллезная инфекция (подходит среда на основе буферного угольно-дрожжевого экстракта с добавлением альфа-кетоглутората, селекционирующими добавками служат полимиксин В, рифабутин и цефуроксим или ванкомицин).