Текст книги "Большая Советская Энциклопедия (МИ)"

Микроскоп (оптич. прибор)

Микроско'п (от микро... и греч. skopéo – смотрю), оптический прибор для получения сильно увеличенных изображений объектов (или деталей их структуры), невидимых невооружённым глазом. Человеческий глаз представляет собой естественную оптическую систему, характеризующуюся определённым разрешением, т. е. наименьшим расстоянием между элементами наблюдаемого объекта (воспринимаемыми как точки или линии), при котором они ещё могут быть отличены один от другого. Для нормального глаза при удалении от объекта на т. н. расстояние наилучшего видения (D = 250 мм ) минимальное разрешение составляет примерно 0,08 мм (а у многих людей – около 0,20 мм ). Размеры микроорганизмов , большинства растительных и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов и сплавов и т. п. значительно меньше этой величины. Для наблюдения и изучения подобных объектов и предназначены М. различных типов. С помощью М. определяют форму, размеры, строение и многие другие характеристики микрообъектов. М. даёт возможность различать структуры с расстоянием между элементами до 0,20 мкм.

  Историческая справка. Свойство системы из двух линз давать увеличенные изображения предметов было известно уже в 16 в. в Нидерландах и Северной Италии мастерам, изготовлявшим очковые стекла. Имеются сведения, что около 1590 прибор типа М. был построен З. Янсеном (Нидерланды). Быстрое распространение М. и их совершенствование, главным образом ремесленниками-оптиками, начинается с 1609—10, когда Г. Галилей , изучая сконструированную им зрительную трубу , использовал её и в качестве М., изменяя расстояние между объективом и окуляром. Первые блестящие успехи применения М. в научных исследованиях связаны с именами Р. Гука (около 1665; в частности, он установил, что животные и растительные ткани имеют клеточное строение) и особенно А. Левенгука , открывшего с помощью М. микроорганизмы (1673—77). В начале 18 в. М. появились в России: здесь Л. Эйлер (1762; «Диоптрика», 1770—71) разработал методы расчёта оптических узлов М. В 1827 Дж. Б. Амичи впервые применил в М. иммерсионный объектив. В 1850 английский оптик Г. Сорби создал первый М. для наблюдения объектов в поляризованном свете.

  Широкому развитию методов микроскопических исследований и совершенствованию различных типов М. во 2-й половине 19 и в 20 вв. в значительной степени способствовала научная деятельность Э. Аббе , который разработал (1872—73) ставшую классической теорию образования изображений несамосветящихся объектов в М. Английский учёный Дж. Сиркс в 1893 положил начало интерференционной микроскопии. В 1903 австр. исследователи Р. Зигмонди и Г. Зидентопф создали т. н. ультрамикроскоп. В 1935 Ф. Цернике предложил метод фазового контраста для наблюдения в М. прозрачных слабо рассеивающих свет объектов. Большой вклад в теорию и практику микроскопии внесли сов. учёные – Л. И. Мандельштам , Д. С. Рождественский , А. А. Лебедев , В. П. Линник .

  Оптическая схема, принцип действия, увеличение и разрешающая способность микроскопа. Одна из типичных схем М. приведена на рис. 1 . Рассматриваемый объект (препарат) 7 располагают на предметном стекле 10. Конденсор 6 концентрирует на объекте пучок света, отражающегося от зеркала 4. Источником света в М. чаще всего служит специальный осветитель, состоящий из лампы и линзы-коллектора (соответственно 1 и 2 на рис. ); иногда зеркало направляет на объект обычный дневной свет. Диафрагмы – полевая 3 и апертурная 5 ограничивают световой пучок и уменьшают в нём долю рассеянного света, попадающего на препарат «со стороны» и не участвующего в формировании изображения.

  Возникновение изображения препарата в М. в основных (хотя и наиболее простых) чертах можно описать в рамках геометрической оптики . Лучи света, исходящие от объекта 7, преломляясь в объективе 8, создают перевёрнутое и увеличенное действительное изображение оптическое 7’ объекта. Это изображение рассматривают через окуляр 9. При визуальном наблюдении М. фокусируют так, чтобы 7' находилось непосредственно за передним фокусом окуляра F_oк . В этих условиях окуляр работает как лупа : давая дополнительное увеличение, он образует мнимое изображение 7’’ (по-прежнему перевёрнутое); проходя через оптические среды глаза наблюдателя, лучи от 7’’ создают на сетчатке глаза действительное изображение объекта. Обычно 7’’ располагается на расстоянии наилучшего видения D от глаза. Если сдвинуть окуляр так, чтобы 7' оказалось перед F_oк , то изображение, даваемое окуляром, становится действительным и его можно получить на экране или фотоплёнке; по такой схеме производят, в частности, фото– и киносъёмку микроскопических объектов (см. Микропроекция ).

  Общее увеличение М. равно произведению линейного увеличения объектива на угловое увеличение окуляра:

(см. Увеличение оптическое ). Увеличение объектива b = D/f "_oб , где D – расстояние между задним фокусом объектива F'_oб и передним фокусом окуляра (т. н. оптическая длина тубуса М.), f’_oб , – фокусное расстояние объектива. Увеличение окуляра, как и лупы, выражается формулой

(f’’_oк берётся в мм ). Обычно объективы М. имеют увеличения от 6,3 до 100, а окуляры – от 7 до 15 (их значения гравируются на оправах). Поэтому общее увеличение М. лежит в пределах от 44 до 1500.

  Разумеется, технически возможно применить в М. объективы и окуляры, которые дадут общее увеличение, значительно превышающее 1500. Однако обычно это нецелесообразно. Большие увеличения не являются самоцелью – назначение М. состоит в том, чтобы обеспечить различение как можно более мелких элементов структуры препарата, т. е. в максимальном использовании разрешающей способности М. А она имеет предел, обуслопленный волновыми свойствами света. (В геометрической оптике, в рамках которой выше было рассмотрено образование изображения в М., отвлекаются от этих свойств света, но предел возможностей М. определяют именно они.) Согласно общей закономерности, наблюдая объект в каком-либо излучении с длиной волны l, невозможно различить элементы объекта, разделённые расстояниями, намного меньшими, чем l. Эта закономерность проявляется и в М., причём количественное её выражение несколько различно для самосветящихся и несамосветящихся объектов. Изображение испускающей монохроматический свет точки, даваемое даже идеальным (не вносящим никаких искажений) объективом, не воспринимается глазом как точка, так как вследствие дифракции света фактически является круглым светлым пятнышком конечного диаметра d , окруженным несколькими попеременно тёмными и светлыми кольцами (т. н. дифракционное пятно, пятно Эри, диск Эри). d = 1,22 l/A , где l – длина волны света (при освещении препарата немонохроматическим светом l – обычно наименьшая длина волны, характеризующая этот свет, либо длина волны, интенсивность излучения на которой максимальна), А – числовая апертура объектива, равная А = n · sin u_m (n – показатель преломления среды, разделяющей светящуюся точку и объектив, u_m – половина угла раствора светового пучка, исходящего из точки и попадающего в объектив). Если две светящиеся точки расположены близко друг от друга, их дифракционные картины накладываются одна на другую, давая в плоскости изображения сложное распределение освещённости (рис. 2 ). Наименьшая относительная разница освещённостей, которая может быть замечена глазом, равна 4 %. Этому соответствует наименьшее расстояние между точками, при котором их изображения можно различить – предельное разрешение М.: d_пр = 0,42d = 0,51 l/A . Для несамосветящихся объектов, как было показано Э. Аббе в его классической теории М., предельное разрешение составляет d_пр = l/(А + А '), где А и A' – числовые апертуры объектива и конденсора М. (значения апертур гравируются на оправах).

  Изображение любого объекта состоит из совокупности изображений отдельных элементов его структуры. Мельчайшие из них воспринимаются как точки, и к ним полностью применимы ограничения, следующие из дифракции света в М. – при расстояниях между ними, меньших предельного разрешения М., они сливаются и не могут наблюдаться раздельно. Существенно повысить разрешающую способность М. можно, только увеличивая А . В свою очередь, увеличить А можно лишь за счет повышения показателя преломления n среды между объектом и объективом (т. к. sinu_m £ 1). Это и осуществлено в иммерсионных системах , числовые апертуры которых достигают величины А = 1,3 (у обычных «сухих» объективов макс. А » 0,9).

  Существование предела разрешающей способности влияет на выбор увеличений, получаемых с помощью М. Увеличения от 500 А до 1000 А называют полезными, т. к. при них глаз наблюдателя различает все элементы структуры объекта, разрешаемые М. При этом исчерпываются возможности М. по разрешающей способности. При увеличениях свыше 1000 А не выявляются никакие новые подробности структуры препарата; всё же иногда такие увеличения используют – в микрофотографии, при проектировании изображений на экран и в некоторых других случаях. Существенно более высокими, чем у М., разрешающей способностью и, следовательно, полезным увеличением обладает электронный микроскоп .

  Методы освещения и наблюдения (микроскопия). Структуру препарата можно различить лишь тогда, когда разные его частицы по-разному поглощают или отражают свет либо отличаются одна от другой (или от окружающей среды) показателем преломления. Эти свойства обусловливают разницу амплитуд и фаз световых волн, прошедших через различные участки препарата, от чего, в свою очередь, зависит контрастность изображения. Поэтому методы наблюдения в М. выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов.

  Метод светлого поля в проходящем свете применяется при исследовании прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Таковы, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д. В отсутствие препарата пучок света из конденсора 6 (рис. 1 ), проходя через объектив 8, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра 9 равномерно освещенное поле. Если в препарате 7 имеется абсорбирующий элемент, то он отчасти поглощает и отчасти рассеивает падающий на него свет (штриховая линия), что и обусловливает появление изображения. Метод может быть полезен и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.

  Метод косого освещения является разновидностью предыдущего, отличаясь тем, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. В ряде случаев это позволяет выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.

  Метод светлого поля в отражённом свете (рис. 3 ) применяется для наблюдения непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд. Освещение препарата 4 (от осветителя 1 и полупрозрачного зеркала 2) производится сверху, через объектив 3, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости 6 объективом совместно с тубусной линзой 5, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

  Метод тёмного поля в проходящем свете (рис. 4 ) применяется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, невидимых при освещении по методу светлого поля. Часто таковы биологические объекты. Свет от осветителя 1 и зеркала 2 направляется на препарат конденсором специальной конструкции – т. н. конденсором тёмного поля 3. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив 5 (который находится внутри этого конуса). Изображение в М. создаётся лишь небольшой частью лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле 4 препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. В поле зрения 6 на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. При этом методе по виду изображения нельзя определить, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.

  Метод ультрамикроскопии, основанный на том же принципе (препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения), даёт возможность обнаружить (но не «наблюдать» в буквальном смысле слова) чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных М. С помощью иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие в препарате частиц размером до 2×10^-9м. Однако определить форму и точные размеры таких частиц с помощью этого метода невозможно: их изображения представляются наблюдателю в виде дифракционных пятен, размеры которых зависят не от размеров и формы самих частиц а от апертуры объектива и увеличения М. Т. к. подобные частицы рассеивают очень мало света, то для их освещения требуются чрезвычайно сильные источники света, например угольная электрическая дуга. Ультрамикроскопы применяются главным образом в коллоидной химии.

  При наблюдении по методу тёмного поля в отражённом свете непрозрачные препараты (например, шлифы металлов) освещают сверху – через специальную кольцевую систему, расположенную вокруг объектива и называемую эпиконденсором.

  Метод наблюдения в поляризованном свете (поляризационная микроскопия) служит для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). К ним относятся многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр. Оптические свойства анизотропных микрообъектов различны в различных направлениях (см. Оптическая анизотропия ) и проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света , падающего на них. Наблюдение можно вести как в проходящем, так и в отражённом свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор; сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него), и эти изменения изучаются с помощью анализатора (см. Поляризационные приборы ) и различных компенсаторов оптических . По таким изменениям можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления , количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации , дихроизме .

  Метод фазового контраста (и его разновидность – т. н. метод «аноптрального» контраста) служит для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К числу таких объектов относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Метод основан на том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Эти фазовые изменения, не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Другими словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Такое изображение называется фазово-контрастным. В типичной для этого метода схеме (рис. 5 ) в переднем фокусе конденсора 3 устанавливается апертурная диафрагма 2, отверстие которой имеет форму кольца. Её изображение возникает вблизи заднего фокуса объектива 5, и там же устанавливается т. н. фазовая пластинка 6, на поверхности которой имеется кольцевой выступ или кольцевая канавка, называемая фазовым кольцом. Фазовая пластинка может быть помещена и не в фокусе объектива (часто фазовое кольцо наносят прямо на поверхность одной из линз объектива), но в любом случае неотклонённые в препарате 4 лучи от осветителя 1, дающие изображение диафрагмы 2, должны полностью проходить через фазовое кольцо, которое значительно ослабляет их (его делают поглощающим) и изменяет их фазу на l/4 (l – длина волны света). В то же время лучи, даже ненамного отклоненные (рассеянные) в препарате, проходят через фазовую пластинку, минуя фазовое кольцо (штриховые линии), и не претерпевают дополнительного сдвига фазы. С учётом фазового сдвига в материале препарата полная разность фаз между отклоненными и неотклонёнными лучами оказывается близкой к 0 или l/2, и в результате интерференции света в плоскости изображения 4' препарата 4 они заметно усиливают или ослабляют друг друга, давая контрастное изображение структуры препарата. Отклоненные лучи имеют значительно меньшую амплитуду по сравнению с неотклонёнными, поэтому ослабление основного пучка в фазовом кольце, сближая значения амплитуд, также приводит к большей контрастности изображения. Метод позволяет различать малые элементы структуры, чрезвычайно слабо контрастные в методе светлого поля. Прозрачные частицы, сравнительно не малые по размерам, рассеивают лучи света на столь небольшие углы, что эти лучи проходят вместе с неотклонёнными через фазовое кольцо. Для подобных частиц фазово-контрастный эффект имеет место только вблизи их контуров, где происходит сильное рассеяние.