Текст книги "Путешествие в страну микробов"

Автор книги: Владимир Бетина

сообщить о нарушении

Текущая страница: 16 (всего у книги 31 страниц)

13. Микробы изменяют свой облик

Хромосома, или ДНК, бактерии Escherichia coli содержит 2000 генов. Она несет в себе информацию о синтезе 2000 различных белков, каждый из которых имеет до 500 аминокислотных остатков.

Дж. Н. Дэвидсон, 1967

Трансформация и трансформационное начало

Вернемся еще раз к явлению трансформации, с которой мы уже познакомились в предыдущей главе. Мы видели, что колонии пневмококков подвержены диссоциации, которая проявляется в изменении их свойств. Клетки пневмококков формы S очень вирулентны (вызывают типичную форму воспаления легких). Они образуют слизистые капсулы, которые обычно прикрывают пары клеток. Эти капсулы состоят из сложного полисахарида. Напротив, пневмококки формы R, образовавшиеся в результате диссоциации формы S, не вирулентны, не образуют капсул и не располагаются парами. Эти различия проявляются во время опытов на животных (определение вирулентности), микроскопирования (по присутствию парнорасположенных клеток с капсулами) и культивирования на питательной среде – агаре (по форме и цвету колоний).

Пневмококки доставили ранее много беспокойств медикам, поскольку врачи еще не располагали пенициллином и другими современными средствами борьбы с воспалением легких. В 1928 году английский бактериолог Ф. Гриффит открыл явление трансформации у этих микроорганизмов. Гриффит испытывал влияние невирулентных R-пневмококков на подопытных мышей. Он привил им миллионы клеток типа R, и мыши погибли. Исследуя органы погибших мышей в поисках этих бактерий, ученый столкнулся с неожиданным фактом: вместо лишенных капсулы пневмококков типа R там были исключительно имевшие капсулы вирулентные пневмококки типа S.

Гриффит предположил, что часть клеток, погибая, выделяет какое-то вещество, которое заставляет оставшиеся в живых клетки R образовывать капсулы. Это предположение он решил проверить следующими опытами. В организм мыши вносилось небольшое количество R-клеток вместе с многочисленными, но умерщвленными высокой температурой S-клетками. Клетки S принадлежали к так называемому типу I. Позднее, как и ожидал Гриффит, из мышей были выделены живые S-клетки. Во втором опыте он использовал живые R-клетки типа I и умерщвленные S-клетки типа II. В этом случае он получил из мышей живые S-клетки типа II. Напрашивалось единственно возможное объяснение: нечто из умерщвленных S-клеток типа II превратило (трансформировало) их родственников – лишенные капсулы R-клетки типа I – в вирулентные S-клетки, способные образовывать капсулы типа II. Чем же было это «нечто», что вызвало трансформацию? Гриффит назвал его трансформирующим началом.

Схема трансформации пневмококков R-формы в S-форму при помощи ДНК, выделенной из клеток S и перенесенной к клеткам R

Это «нечто», обладающее способностью активного действия, привлекло внимание исследователей, и не удивительно, что К. Т. Эйвери со своими коллегами из Рокфеллеровского университета попытался вскрыть его сущность. В 1944 году ученые с достоверностью доказали, что трансформирующим началом была ДНК из S-клеток. Читателю, уже немало узнавшему о генетической роли ДНК, такой результат представляется довольно очевидным. Но те, кто впервые с ним столкнулся, были в менее выгодном положении.

Первой задачей исследователей было вырастить достаточное количество клеток вирулентных пневмококков, чтобы получить из них трансформирующее начало. После их умерщвления и разрушения при помощи дезоксихолата натрия (вещества, содержащегося в желчи) они получили около 1 мг чистой ДНК из 30 миллиардов клеток. Если воздействовать этим веществом на R-клетки, то в их потомстве 1 % клеток начинает образовывать капсулы, и это свойство наследственно передается из поколения в поколение. Трансформация, таким образом, вызывалась при помощи ДНК из вирулентных пневмококков. Это позволило исследователям сделать вывод, что ДНК является трансформирующим началом.

Последовали подтверждения из многих микробиологических лабораторий мира, где также удалось провести трансформацию бактерий, но уже других, в частности кишечной палочки Escherichia coli. Трансформирующим началом во всех случаях была ДНК.

Однако, пневмококки в этом отношении занимали, как оказалось, особое положение, поскольку у них удалось трансформировать более 25 наследственных признаков, среди которых была способность к образованию капсул из полисахаридов, а также к созданию особых типов колоний и устойчивость к лекарственным препаратам. При трансформации обычно переносится лишь один из наследуемых признаков даже в том случае, если используется ДНК из пневмококков, обладающих двумя или тремя отличительными признаками. Если, например, на 1 000 000 клеток пневмококка формы R действовать десятимиллионной частью грамма ДНК из пневмококка формы S, устойчивой к пенициллину и стрептомицину, то трансформируется лишь 50 000 клеток. Из них приблизительно 49 000 получат одно из переносимых свойств (способность образовывать капсулы или устойчивость к определенному лекарству), около 800 клеток приобретут два новых свойства и только 4 клетки получат все три новых признака: способность к образованию капсул, устойчивость к пенициллину и устойчивость к стрептомицину.

ДНК при трансформации нередко передает и такие свойства, которые долгое время могут оставаться скрытыми и проявляются лишь при особых обстоятельствах. Так, например, трансформацией объясняется передача способности к созданию фермента, вызывающего окисление маннита (вещества, близкого к сахару маннозе). Этот фермент проявится только в том случае, если мы будем выращивать пневмококки на питательной среде, где единственным источником углерода будет маннит. Трансформированные пневмококки начнут окислять маннит и использовать его как источник углерода и энергии, тогда как их нетрансформированная «родня» в этой среде не будет расти и размножаться.

Интересно, что однажды трансформированные бактерии не теряют в дальнейшем способности к новой трансформации, особенно к такой, которая совершается с помощью ДНК, обладающей многими закодированными свойствами.

Читатель познакомится также и с такими важными проблемами, какой является, например, в наше время – в эру антибиотиков – устойчивость некоторых болезнетворных микробов к антибиотикам. Если, например, стафилококки стали устойчивыми к пенициллину, то лечение им инфекционных заболеваний, вызванных этими стафилококками, окажется бесполезным. Американский естественнонаучный журнал Science опубликовал в 1962 году сообщение о том, что ДНК, содержащаяся в восприимчивых к пенициллину стафилококках, может трансформировать устойчивые к нему стафилококки в чувствительные. К сожалению, такую трансформацию трудно осуществить в большом масштабе, иначе мы смогли бы трансформировать устойчивых представителей стафилококков в чувствительные и затем уничтожить их пенициллином!

Бактериофаги в действии

Мы уже познакомились со строением вирусов. Узнали мы и об их сходстве с неживыми химическими соединениями. Теперь нам предстоит подробнее рассмотреть особенности, связывающие их с живыми организмами.

Итак, мы уже знаем, что вирусы сходны с последними прежде всего способностью размножаться. Однако их размножение происходит лишь в живых клетках хозяина. Сведения о том, как вирус проникает в клетку и как производит в ней разрушительные изменения, впервые были получены при наблюдениях над бактериофагами – врагами кишечной бактерии Escherichia coli. Электронный микроскоп помог нам раскрыть тайну внешнего строения бактериофага Т4, изображенного на фото 49. Ниже дана схема строения фага Т2. Частица фага имеет головку, напоминающую шестигранную призму с шестигранными же крышечками с обеих сторон. От головки отходит продолговатый хвостовой придаток, конец которого снабжен несколькими нитевидными «щупальцами». В придатке имеется канал, который соединяет его с головкой и в котором находится макромолекула ДНК. Остальные части оболочки фага – белковой природы.

Модель бактериофага Т2 – паразита-бактерии Escherichia coli. Граненая головка соединена с хвостовым придатком, имеющим внутренний канал и выросты для прикрепления к бактерии. На модели хвостовой придаток сжался и из него выдвинулась трубка с каналом, по которому ДНК проникает в бактерию.

Бактериофаг Т2 не имеет, по существу, двигательных органов и в жидкой среде перемещается пассивно, в результате столкновения с молекулами среды. Таким образом, он приходит в соприкосновение и с бактерией. Фаг «пристает» к ее поверхности при помощи щупалец. В конце хвостового придатка содержится фермент, поражающий оболочку бактерии и «проедающий» в ней небольшое отверстие. После этой операции придаток втягивается (укорачиваясь подобно гармонике) в тело фага.

ДНК из головки бактериофага через канал в хвостовом придатке и через образованное отверстие в стенке бактерии проникает в клетку. Все это несколько напоминает процедуру инъекции при помощи шприца. Белковая оболочка головки и придатка остаются снаружи, а в клетку бактерии входит только ДНК. И начинается драматическая фаза – «саморазмножение» ДНК фага. Макромолекула ДНК «принуждает» бактерию участвовать в процессе своего размножения, используя ее «сырье» и весь ферментный аппарат.

Как мы уже знаем, молекула ДНК образует подобие двойной спирали, состоящей из двух свернутых цепочек. При ее размножении эти цепочки, развертываясь, освобождаются друг от друга и к каждой из них присоединяются из среды основные структурные единицы (нуклеотиды), дополняя недостающую половину молекулы. Из первичной макромолекулы ДНК возникают две дочерние, а со временем их раскрученные цепочки дополняются новыми нуклеотидами. В результате появляются уже 4 макромолекулы, и вскоре число их возрастает до 8, 16 и т. д. По прошествии получаса из одной первичной молекулы ДНК фага в клетке находятся уже 150–300 ее потомков, принуждающих бактерию синтезировать белок для головки и хвостового придатка бактериофага. Клетка лопается, как воздушный шарик, выпуская в среду 150–300 бактериофагов, и те стремительно нападают на следующие бактерии. Процесс повторяется, и еще через полчаса в среде уже десятки тысяч фагов. Спустя некоторое время там не остается ни одной живой бактерии, кишат лишь победившие бактериофаги.

Весь этот процесс уничтожения бактерий и размножения фагов можно наблюдать под электронным микроскопом (фото 50). Впрочем, результаты такого уничтожения можно увидеть и невооруженным глазом. С этой целью в чашку Петри с агаризованной питательной средой наносят несколько капель культуральной жидкости, содержащей бактерии. Внесем туда же несколько капелек из другой жидкой среды, в которой находятся бактериофаги. Перемешаем их и равномерно нанесем несколько капель этой смеси на поверхность агара. Затем чашку Петри поместим в термостат при температуре 37 °C. Через 24 часа мы обнаружим следующую картину.

Несколько сотен бактериофагов, помещенных на поверхность агара, уже вошли в контакт с клетками бактерий и сделали свое дело. Там же находятся и клетки, избежавшие нападения фагов и продолжающие нормально размножаться. На поверхности питательной среды образуется видимый невооруженным глазом налет, местами прерванный округлыми пятнами правильной формы, на которых бактерии отсутствуют. Эти пятна – свидетельство уничтожающей деятельности бактериофагов (фото 51).

Вирусологи ищут доказательства

При наблюдении в электронном микроскопе соприкосновения бактериофага с бактерией трудно установить, какая часть фага проникает в клетку и что остается снаружи (если остается!). Читатель может справедливо заметить, что рассказ о проникновении ДНК фага в бактериальную клетку и о том, что внешние его оболочки остаются вне этой клетки, является плодом фантазии. Каким же образом доказать то, о чем даже электронный микроскоп не может дать достаточно четкой информации?

В иерархии субмикрокосмоса существуют, однако, еще более мелкие единицы – атомы радиоактивных изотопов (их вирусологи и призывают в подобных случаях на помощь). Молекулы соединений, содержащие такие изотопы, легко отличить от других молекул. Они выделяются своей радиоактивностью, которая измеряется точными и чувствительными приборами.

В 1952 году два исследователя, А. Херши и М. Чейз, одновременно призвали на помощь радиоактивные изотопы: фосфор ³²Р и серу ³⁵S. Почему именно эти, а не другие? Да потому, что фосфор встречается только в ДНК бактериофагов, а сера может входить только в состав их белков.

Культуру бактерий выращивали на питательной среде, содержавшей в качестве источника биогенного фосфора исключительно ³²Р. Практически бактерии не могут отличить радиоактивный фосфор от обычного и потребляют среду с ³²Р. Таким путем атомы с ³²Р попадают в бактериальные клетки, которые затем могут стать добычей бактериофагов. И ³²Р уже входит в состав ДНК бактериофагов. Подобный опыт повторили в другой пробирке, с радиоактивными соединениями серы ³⁵S, и получили бактериофаги, имеющие в своем белке ³⁵S.

Этими фагами и инфицировали потом бактерии, выращенные в среде, не содержащей радиоактивных соединений. Сначала использовались бактериофаги с радиоактивной серой. Процесс инфицирования был завершен в течение нескольких минут, после чего центрифугированием отделили зараженные бактерии от остатков бактериофага и определили их радиоактивность. У бактерий не было и признаков радиоактивности, тогда как «опустошенные» фаги (головки и хвостовые придатки) проявляли повышенную радиоактивность. Значит, в бактерии проникла из фага только ДНК (не содержащая серы!), в то время как белок, в состав которого входила ³⁵S, остался вне клеток.

Потом последовал опыт с фагами, содержащими в своей ДНК радиоактивный фосфор (белки фагов фосфора не содержат!). Через несколько минут после заражения бактерий остатки фагов и зараженные бактерии были тем же способом разделены и исследованы на радиоактивность. На этот раз она была обнаружена в клетках бактерий! Таким образом, было достоверно доказано, что при поражении бактерий фагами внутрь бактериальных клеток проникает ДНК фага (содержащая фосфор), а снаружи остается его белковая оболочка (содержащая серу).

Бактериофаг как переносчик информации

Из рассказа о бактериофагах, принуждающих клетки бактерий к синтезу ДНК и белкового компонента фагов, мы узнали, что один-единственный фаг может вызвать среди бактерий настоящую эпидемию и за короткий срок уничтожить в жидкой питательной среде миллиарды их клеток.

Но при некоторых обстоятельствах появление бактериофага у микробной клетки не обязательно заканчивается ее гибелью. ДНК из фага проникает в клетку, однако, клетка продолжает жить, как будто бы ничего не произошло. Это напоминает проникновение в команду корабля замаскированных пиратов, которые под видом дружески настроенных матросов тайно подготавливают диверсию, выжидая лишь подходящего момента… Пораженная бактерия продолжает внешне беспрепятственно расти и время от времени в соответствующих условиях делиться на две новые клетки…

Но что-то изменилось в ее свойствах – бактерия приобрела устойчивость к фагам определенного типа. И это является единственным свидетельством того, что в ее клетке находится фаговая ДНК. Специалисты говорят в таких случаях о неинфекционных, или симбиотических, фагах и лизогенных[24]24
  Лизогенные – несущие в себе возможности растворения клеток, их лизиса. – Прим. перев.


[Закрыть] бактериях. «Лизогенных» – потому что в какой-то момент по якобы совершенно непонятной причине 2–3 клетки из миллиарда вдруг расплачиваются за свое гостеприимство и погибают. А из погибших клеток вырываются в среду сотни бактериофагов. Достаточно перенести одну капельку этой среды в другую культуру восприимчивых бактерий, чтобы разразилась катастрофа и почти вся культура в короткий срок погибла.

Почти, но не вся! Некоторые клетки переживут атаку бактериофагов. Но эти счастливчики, перенесшие первый удар, как-то изменятся, приобретут новые свойства и передадут их следующему поколению.

Что же, собственно, при этом происходит? Дж. Ледерберг из Станфордского университета (Калифорния), первый наблюдавший это явление, объясняет его следующим образом. После проникновения фаговой ДНК в лизогенную бактерию обычного размножения фагов не происходит и гибель клетки не наступает. В этом случае фаговая ДНК присоединяется к бактериальной, которая находится в хромосоме клетки. Когда же эта клетка начинает делиться на две дочерние, разделяется и хромосома, причем вдвое увеличивается и количество ДНК из фага и половина ее попадает в каждую из новых хромосом. Итак, при каждом дальнейшем делении клеток фаговая ДНК переносится в каждую из дочерних клеток. Среди миллиардов клеток, естественно, окажутся и такие, в которых фаговая ДНК освободится из хромосомы и начнет бурно размножаться, а клетка погибнет. В некоторых из них ДНК фага захватывает с собой и частичку клеточной хромосомы, и новообразовавшиеся частицы фага содержат в этом случае, кроме собственной ДНК, «кусочек» бактериальной хромосомы. Когда такой фаг встречается с другой восприимчивой клеткой, то вместе с фаговой ДНК в нее попадает частица бактериальной ДНК, и они уже совместно присоединяются к хромосоме новой клетки-хозяина. Фрагмент чужой хромосомы сливается с хромосомой этой клетки, и последняя обогащается, таким образом, новыми генами. Внешне это проявится в приобретении клеткой какого-то нового свойства. Если, например, чужеродный ген определял синтез вещества, которое до этого «обогатившаяся» клетка не могла образовывать, то эту способность получала не только сна сама, но и ее потомство. Приобретенным свойством она обязана гену, попавшему в клетку с помощью бактериофага. Ледерберг назвал такую форму наследственных изменений трансдукцией.

При помощи «бактериофага 80» методом трансдукции удалось перенести свойство устойчивости к пенициллину на бактерию, ранее проявлявшую повышенную восприимчивость к этому антибиотику. Этот же бактериофаг перенес свойство устойчивости и на два других антибиотика, но в данном случае далеко не все «фаги 80» приняли участие в трансдукции, ее осуществлял только один из миллиона.

Могут ли бактерии конъюгировать?

Ледерберг и его старший коллега Тейтем открыли еще одно важное свойство бактерий. Они установили, что кишечные бактерии Escherichia coli имеют половые различия. Одни клетки проявляют характер женских индивидов, другие – мужских. Методом, описанным в следующем разделе, из этих бактерий были выделены два различающихся штамма (мутанта): один из них нуждается в ростовых веществах биотине (Б) и метионине (М), другой – в лейцине (Л) и треонине (Т). Первый штамм ученые стали обозначать формулой Б^-М^-Т⁺Л⁺, а второй – Б⁺М⁺Т^-Л^-, где знак плюс отражает способность, а знак минус – неспособность штаммов синтезировать то или иное ростовое вещество.

Из каждого штамма взяли по 10 миллионов клеток, смешали их и посеяли на агаризованную среду, в которой не было ни одного из упомянутых ростовых веществ. Обычно ни тот ни другой тип бактерий на таком агаре не развивались, так как обоим не хватало по два ростовых вещества. И тем не менее на агаре появилось около ста колоний. Чем это объяснить? Исследования Ледерберга и Тейтема показали, что в разросшихся колониях все бактерии были нового типа (Б⁺М⁺Т⁺Л⁺). По-видимому, некоторые клетки из обоих штаммов конъюгировали между собой, причем мужская клетка передала женской клетке часть своей хромосомы, именно ту ее часть, в которой были гены, определяющие способность синтеза двух ростовых веществ, ранее не вырабатывавшихся «женской» клеткой. Теперь она стала самостоятельной и, получив в своей хромосоме два новых гена, приобрела возможность образовывать все четыре ростовых вещества.

Несколько позднее с помощью электронного микроскопа было установлено, что при конъюгации (как назвали этот процесс Ледерберг и Тейтем) две бактерии действительно соединяются друг с другом «копуляционным мостиком» (фото 52). При этом мужская клетка отдает часть своей хромосомы женской клетке.

Жакоб из Пастеровского института со своим коллегой Э. Вольманом придумали оригинальный метод наблюдения за ходом конъюгации у бактерий. Они смешали мужской и женский типы бактерий в жидкой среде и через определенные промежутки времени отбирали пробы, помещая их затем в смеситель и продолжительно встряхивая, чтобы отделить друг от друга соединившиеся клетки. Затем они, так же как Ледерберг и Тейтем, зарегистрировали увеличение числа новых генов в «женских» клетках. Обозначим гены «мужской» хромосомы буквами А – Б—В – Г—Д – Е—Ж—3 и проследим вместе с Вольманом и Жакобом с часами в руках их перемещение из «мужских» клеток в «женские» (см. рис. на стр. 146)

Смешивать культуры «мужских» и «женских» бактерий они начали ровно в 9 часов. В 9.05 брали первую пробу, в 9.10 – вторую, в 9.20 – третью, в 9.30 – четвертую и в 9.35 – пятую. Затем встряхиванием разделяли спаренные клетки и, пересеяв их на агар, оставляли до следующего дня. И вот каков был результат: по прошествии 5 мин «женские» клетки не содержали еще ни одного «мужского» гена; через 10 мин в них был уже ген А, через 20 мин – гены А и Б, через 30 мин – гены А, Б и В, а спустя 35 мин положение уже не изменялось. Таким образом, конъюгация позволила «женским» клеткам получить три новых гена. А это означает, что они стали уже иными. Обогатившись тремя генами, они приобрели и иные свойства, которые передадутся следующим поколениям. Бактерии изменили свою природу!