Текст книги "Путешествие в страну микробов"

Автор книги: Владимир Бетина

сообщить о нарушении

Текущая страница: 14 (всего у книги 31 страниц)

11. Нас подстерегают неожиданности

Природа удивительным образом проявляется гораздо сложнее и интереснее, чем мы могли бы вообразить.

В. А. Амбарцумян, 1965

Еще о «живых кристаллах»

В 1946 году Стэнли была присуждена Нобелевская премия за открытие явления кристаллизации ВТМ. К тому времени уже были известны и другие кристаллизующиеся вирусы, полученные последователями американского биохимика из больных растений.

Спустя двадцать лет сотрудники Лаборатории вирусов Калифорнийского университета добились дальнейших значительных успехов: они кристаллизовали животный вирус, причем один из самых мелких – вирус полиомиелита. Этот период характеризуется бурным развитием вирусологии. Вирусологи научились не только обнаруживать возбудителей вирусных заболеваний, но и культивировать их. Сначала для этих культур использовали подопытных животных, позже стали применять зародышей цыплят, а затем и искусственные культуры тканей из организма животных (фото 40).

Сотрудники упомянутой Лаборатории вирусов выращивали вирус полиомиелита на культуре ткани из почек обезьяны. Искусственные ткани культивировались на питательной жидкости, а в их клетках жили и размножались частицы вируса полиомиелита. Дальнейшим этапом было выделение вируса, и основными «рабочими орудиями» для этого служили ультрацентрифуга и электронный микроскоп. На дне центрифужных пробирок при скорости в несколько десятков тысяч оборотов в минуту из фильтрата питательной жидкости постепенно оседали невидимые простым глазом частицы вируса полиомиелита. Полученная суспензия была исследована под электронным микроскопом. Комбинацией различных химических методов ученым удалось наконец достигнуть намеченной цели – выделить один-единственный кристаллик вируса (фото 41, а). Из миллионов частей культуральной жидкости только три части приходились на вирус. Интересно было рассмотреть скол такого кристалла (фото 41, в): электронный микроскоп вскрыл правильное расположение отдельных частиц вируса. Чтобы образовать один едва видимый в микроскоп кристаллик, потребовались миллиарды этих частиц!

Через год ученым удалось кристаллизовать уже три известных типа вируса полиомиелита. Это было как раз в том году, когда Р. Л. Стире установил, что ВТМ кристаллизуется не только в искусственных условиях, его кристаллы образуются и в клетках пораженных растений.

Немного позднее вирусологи К. Ф. Маттерн и X. Дюбуа опубликовали сообщение о получении кристаллов вируса Коксаки (фото 42).

К настоящему времени вирусологи открыли уже несколько сотен вирусов. Из них в относительно очищенном виде выделены примерно 30, а около 20 вирусов получены в абсолютно чистом виде.

Строение ВТМ

Вирус табачной мозаики изучен гораздо лучше других вирусов. Его размеры и форма нам уже хорошо известны. Но каково внутреннее строение частицы этого вируса?

Рибонуклеиновая кислота находится в вирусной частице в виде простых спиралей, которые скрыты в цилиндре, представляющем макромолекулу белка. Внутри частицы имеется полый «канал», как у изолированного провода, из которого вытянули проволоку. Диаметр этого канала достигает 4 нм (фото 43).

Макромолекула белка состоит из мелких пептидных цепей (субъединиц); в каждой частице ВТМ их в среднем около 2200. Эти цепи, образующие как бы «плащ» поверх спирали РНК, представляют более крупную спираль, внешний диаметр которой равен 17–18 нм. С каждым оборотом спирали на 360° в белковом «плаще» прибавляется 16 1/3 новых пептидных цепей и длина его увеличивается на 2,3 нм. Общее число витков около 130.

Цепи, из которых состоят белки, химически всегда однородны. Данные об их строении были опубликованы почти одновременно двумя группами исследователей: Г. Шраммом с сотрудниками из Института Макса Планка в Тюбингене (ФРГ) и X. Л. Френкель-Конратом с сотрудниками из Лаборатории вирусов Калифорнийского университета. Обе группы независимо друг от друга установили, что каждая субъединица состоит из цепи аминокислот, объединенных пептидными связями в полипептиды. Но если немецкие ученые насчитали 157 молекул аминокислот в одной такой субъединице, то американские увидели на одну больше. И как показали более поздние исследования, вторая цифра оказалась правильной.

В каждой субъединице представлены 16 различных аминокислот. Их названия, сокращенные символы и количество молекул в субъединице приведены в таблице 6.

Субъединица белкового цилиндра вируса табачной мозаики образуется соединением 158 аминокислотных остатков, размещенных в определенном порядке.

Расположение аминокислот в субъединице, установленное сотрудниками Лаборатории вирусов, видно из приведенного рисунка.

На фото 44 представлена модель ВТМ с яйцевидными субъединицами белков и витками РНК, которые обозначены черным.

Основными субъединицами РНК являются нуклеотиды. Различают четыре типа этих соединений: адениловая, гуаниловая, цитидиловая и уридиловая кислоты. В целой спирали РНК насчитывается 6500 нуклеотидов, но их расположение еще неизвестно.

Вся молекула ВТМ состоит приблизительно из 5 250 000 атомов следующих биогенных элементов: углерода, водорода, кислорода, азота, фосфора и серы. Пять с четвертью миллионов атомов распределены между 6500 нуклеотидами в молекуле РНК и 2200 субъединицами белков, каждая из которых содержит 158 аминокислотных остатков. И несмотря на такую сложность состава и структуры, вирус табачной мозаики имеет длину, равную всего лишь трем десятитысячным, а ширину – 18 миллионным долям миллиметра.

Что представляла бы собой частица ВТМ при увеличении ее в миллион раз? Это был бы небольшой цилиндр длиной около 30 см и диаметром 1,5 см. Увеличенная еще в тысячу раз, она напоминала бы цилиндрическую башню диаметром 18 м и высотой 300 м. Если бы у этой башни было 2200 лестничных ступенек, то каждая из них соответствовала бы одной белковой субъединице ВТМ, причем высота ее равнялась бы 14 см и состояла бы она из 158 кирпичей шестнадцати различных типов. В этом случае каждый кирпич отвечал бы одной молекуле из 16 типов аминокислот, присутствующих в белковых субъединицах. При подъеме по такой винтовой лестнице на верхушку башни мы сделали бы 130 витков вокруг ее оси. И если бы к концу путешествия у нас не закружилась голова и мы смогли бы заглянуть в цилиндрическую шахту четырехметрового диаметра, находящуюся в центре башни, то увидели бы в ней 6500 многогранников, поставленных друг на друга по спирали. Эта спираль соответствовала бы спирали РНК вирусной частицы, состоящей из 6500 нуклеотидов. Многогранники были бы к тому же четырех типов, что отвечает четырем типам нуклеотидов, участвующих в структуре макромолекулы РНК.

Наконец, приведем еще одно сравнение: частица нашего вируса относилась бы к этой фантастической башне как 1 секунда к 32 годам!

Геометрия и вирусы

Такой строгой симметрией, какую мы видели в архитектонике частицы ВТМ, отличаются и все прочие вирусы. Косвенным доказательством этого является и строение кристаллических вирусов, обнаруженное при помощи особого рентгеновского аппарата, который применяется для изучения строения молекул различных соединений. Эти данные успешно дополняются и непосредственным наблюдением вирусных частиц в электронном микроскопе при увеличении их в сотни тысяч раз. Для этой цели препараты вирусов обрабатываются фосфорно-вольфрамовой кислотой, не пропускающей электроны. Эта жидкость заполняет крошечные пространства между отдельными субъединицами вирусной частицы. При наблюдении в электронном микроскопе электроны проходят только сквозь «не-затененные» белковые цепи, образуя как бы подобие негативного изображения вирусных частиц. При этом можно убедиться в строго симметричном расположении субъединиц вируса.

Сходную с ВТМ спиральную структуру имеют и многие другие вирусы. Например, миксовирусы, составляющие группу возбудителей ряда болезней человека и животных (вирусы гриппа, свинки и др.). Правда, некоторые миксовирусы имеют еще более сложное, но всегда симметричное строение. Модель такого чрезвычайно сложного по строению вируса представлена на фото 45.

Частицы других вирусов напоминают своей формой многогранники, и вирусологи относят их к группе вирусов с икосаэдрической симметрией (икосаэдр – двадцатигранник, стенки которого представляют собой равносторонние треугольники). Частице аденовирусов, например, соответствует модель, состоящая из 252 шаровидных субъединиц (фото 45, в), частице вируса герпеса отвечает модель из 162 субъединиц. Самый мелкий из известных нам вирусов – бактериофаг ØX174, у которого только 12 поверхностных субъединиц.

Отдельная вирусная частица – это основная инфекционная единица данного вируса. Она состоит из белковой «оболочки» и скрытой в ней молекулы нуклеиновой кислоты. Мы уже говорили, что частицы вирусов отличаются от клеток еще и тем, что всегда содержат лишь один тип нуклеиновой кислоты. Частицы ВТМ, мы знаем, содержат РНК; эта же нуклеиновая кислота находится в частицах вируса гриппа и полиомиелита. Но в частицах упомянутого аденовируса имеются молекулы ДНК.

Обе нуклеиновые кислоты, ДНК и РНК, выполняют в каждой вирусной частице важные «дирижерские» функции, подобно тому как они делают это в клетках бактерий и других организмов.

Рассмотрение нами вопросов строго определенной геометрической структуры и симметрии в вирусах было бы неполным, если бы мы не рассказали, хотя бы вкратце, об их размерах. Одна активная инфекционная единица вируса называется вирионом. Вирионы различных типов вирусов отличаются не только строением, но и тем, какую именно кислоту они содержат – ДНК или РНК. Определяющим признаком служит и их величина (в случае вирусов мы охотнее употребили бы слово «малость», а не «величина»). Вирус табачной мозаики по своей длине находится на верхней границе возможных размеров вирусов, он достигает 300 нм, или трех десятитысячных долей миллиметра. К наименьшим вирусам относится вирус различных форм ящура, частицы которого имеют диаметр 24 нм, или двадцать четыре миллионные доли миллиметра.

12. Молекулы наследственности и микробы

Каждая живая клетка представляет собой микрокосмос, в котором нуклеиновая кислота выступает в качестве диктатора, обычно к нам благоволящего; но в случае рака она становится деспотом-садистом, а в вирусных частицах – узурпатором.

У. М. Стэнли

Диссоциация и трансформация

В первой главе читатель узнал о борьбе между приверженцами плеоморфистского и мономорфистского направлений в микробиологии конца XIX века. Эта борьба закончилась победой мономорфистов – сторонников учения о неизменности микробов. Однако победа эта была далеко не окончательной.

Уже в 20-е годы мономорфистская теория впервые подверглась сомнению. Стало известно явление так называемой диссоциации бактерий. При выращивании пневмококков, вызывающих воспаление легких (см. фото 57), было обнаружено, что их колонии на питательном агаре изменяют свой облик. Поначалу гладкие и блестящие (обозначим их состояние буквой «S», от английского smooth – гладкий), они становились через некоторое время шероховатыми и сморщенными по краям (обозначим их буквой «R», от английского rough – шероховатый).

Клетки из колоний R отличались от клеток из колоний S еще и тем, что были значительно менее вирулентными, иначе говоря, их способность вызывать заболевание стала значительно слабее. Следует отметить, что обратного превращения R-формы в S-форму никогда не наблюдалось. Этот переход S→R и получил название диссоциации (фото 46).

Следующее неожиданное открытие последовало через несколько лет, когда удалось осуществить изменение пневмококков в обратном направлении, из состояния R в S. Это изменение, протекающее в обратном направлении, в отличие от диссоциации получило название трансформации.

В 1944 году к вопросу трансформации вернулись вновь. Американские микробиологи К. Т. Эйвери, К. М. Маклеод и М. Маккарти доказали, что трансформацию вызывает содержащаяся в пневмококках дезоксирибонуклеиновая кислота! Это выглядело, однако, довольно смелым утверждением… И означало, что сама ДНК была передатчиком наследственных изменений.

Поиск и изучение нуклеиновых кислот

Проблемой нуклеиновых кислот занимался еще в 1868 году швейцарский химик Ф. Мишер, открывший в клетках гноя особое вещество, названное им «нуклеином», поскольку оно встречалось исключительно в клеточном ядре (nucleus – ядро). Это была ДНК. Она находится в каждой из двух биллионов клеток человеческого организма и в клетках всех прочих организмов. Мы знаем также, что ДНК присутствует и в некоторых бактериофагах и вирусах. Спустя 30 лет в клетках дрожжей открыли другую нуклеиновую кислоту, ее мы теперь сокращенно обозначаем РНК.

Во всех клеточных ядрах организма (фото 47) количество ДНК всегда одинаково.

ДНК – длинная макромолекула, основными структурными элементами которой являются нуклеотиды. Каждый нуклеотид состоит из 29–35 атомов. Нуклеотид построен из трех структурных элементов: органического основания, углевода и фосфорной кислоты. Углевод, который в ДНК называется дезоксирибозой, и фосфорная кислота во всех нуклеотидах одинаковы; органических оснований в нуклеотидах несколько: аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г) или цитозин (Ц).

РНК отличается от ДНК тремя основными особенностями: вместо дезоксирибозы содержит близкий к ней сахар – рибозу; вместо тимина (Т), присутствующего только в ДНК, – урацил (У), и наконец, в отличие от ДНК, являющейся двойной цепью, напоминает простую длинную цепь, в которой нуклеотиды расположены последовательно в ряд. До сих пор в этом отношении известно только единственное исключение – бактериофаг с шифром ØX174 имеет ДНК в виде простой, а не двойной цепи.

Простая цепь РНК состоит из чередующихся молекул рибозы и остатков фосфорной кислоты, причем к каждой молекуле рибозы перпендикулярно оси цепи присоединяется одно из четырех нуклеотидных оснований – У, Г, Ц или А. Часть молекулы РНК изображена в виде следующей схемы:

где Р означает рибозу, Ф – остаток фосфорной кислоты, У, Ц, А и Г – различные нуклеотидные основания.

Изучение структуры ДНК продолжалось долгие годы начиная с 20-х годов, когда о ДНК было известно примерно столько же, сколько мы сейчас рассказали.

В начале 50-х годов профессор Е. Чаргафф и его коллеги установили, что в молекуле ДНК определенно взаимосвязаны два спаренных основания, причем всегда аденин с тимином (А – Т), а гуанин с цитозином (Г – Ц). Количественные отношения между этими парами в молекуле ДНК одного и того же биологического вида всегда постоянны, но различаются у разных видов. Чем более родственны виды между собой, тем более сходны и количественные отношения этих пар в ДНК и наоборот, чем меньше родства между видами, тем эти отношения менее сходны.

Приблизительно в это же время американский биохимик Л. Полинг исследовал вместе со своим сотрудником Р. Кори структуру белка. Они установили, что полипептиды (ряды связанных в цепи аминокислот) образуют некоторое подобие спирали, так называемую α-спираль.

Вскоре после этого англичанин М. Уилкинс и другие исследователи доказали, что и макромолекулы ДНК имеют такую же спиральную структуру. Американец Дж. Уотсон и англичанин Ф. Крик на основании этих и других данных построили структурную модель молекулы ДНК. За эту, по существу, новаторскую работу Уотсон, Крик и Уилкинс были удостоены в 1962 году Нобелевской, премии по медицине и физиологии. Уотсон и Крик в своей модели наглядно изобразили структуру молекулы ДНК в виде двойной спирали. Внешние витки этой макромолекулы образуют цепи, в которых закономерно чередуются молекулы дезоксирибозы (Д) и фосфорной кислоты (Ф). Цепи как бы намотаны на внутренний «цилиндр», состоящий из спаренных оснований А – Т и Г – Ц. С наружной стороны основания присоединены к дезоксирибозе другой цепи. Между собой основания связаны водородными мостиками, известными по многим другим соединениям. Внутреннюю организацию молекулы ДНК можно изобразить следующей схемой:

Обе цепи обхватывают внутренний цилиндр так, что их витки всегда находятся на его противолежащих сторонах. Каждый поворот цепей на 360° размещает новые 10 пар нуклеотидов. Модели молекул ДНК с их двойными спиралями наглядно изображены на прилагаемом рисунке.

Количество нуклеотидов в ДНК возрастает с усложнением организмов. Бактериофаги содержат в своих молекулах ДНК около 5000—10 000 нуклеотидов, но у бактерий их уже около 5 000 000. Каждая клетка человеческого организма содержит до 800 000 молекул ДНК, и в каждой из них имеется около 40 000 нуклеотидов.

ДНК в роли диктатора

Мы уже упоминали, что ДНК как «трансформационный фактор» изменяет наследственные свойства пневмококков. Мир микробов представляет нам все больше свидетельств того, что ДНК является генетическим материалом клетки, управляющим тысячами происходящих в ней химических реакций. Эти реакции направлены на сохранение и размножение клеточных структур. Деятельность ДНК, таким образом, тесно связана с размножением и наследственностью.

Вопросами передачи наследственных свойств от поколения к поколению занимается генетика, давно установившая, что главным органом, «ответственным» за эту передачу, является клеточное ядро, хотя в последнее время стала известна немалая роль в этих процессах и самой цитоплазмы. Эта ответственность за передачу наследственных свойств сосредоточена в ядре, в образованиях, которые называются хромосомами (фиг. V и VI). Позднее генетики доказали, что носителями тех или иных характерных особенностей организма, передающихся из поколения в поколение, являются определенные участки хромосом, ген ы. С генами тесно связана и способность клетки осуществлять определенные химические реакции. Как же работают гены и какова их сущность? Долгое время для ученых это оставалось загадкой.

Модель двойной спирали ДНК. Внешние цепочка возникают соединением остатков дезоксирибозы (пятиугольники на правых схемах) с остатками фосфорной кислоты. «Мостики» между остатками дезоксирибозы образуются соединением двух пар А – T и Г – Ц.

В 40-х годах начался период «химизации» генетики. Два американских генетика, Дж. Бидл и Э. Тейтем, экспериментально показали, что возникновение и активность каждого фермента в клетке контролируется определенным геном; их теорию характеризует утверждение «один ген – один фермент». Это было еще одним шагом к познанию генов, которые в то время считали белками.

Через некоторое время пришло открытие химического состава «передаточного начала» бактерий, и генетики уточнили свое представление о генах. Их стали считать нуклеопротеидами, то есть сложными соединениями ДНК с белком.

В процессе митоза, когда клетка подготавливается к делению на две новые, с хромосомами происходят удивительные превращения. Каждая хромосома делится вдоль на две части, и обе части попадают в ядра двух новых, дочерних клеток. Таким образом, обе клетки получают поровну тот генетический материал, количество которого в материнской клетке перед митозом (в так называемой интерфазе) удвоилось. Но поскольку генетический материал содержит ДНК, очевидно, что и ее количество увеличилось в два раза. В настоящее время это уже достоверно доказано.

Но если ДНК является химическим носителем наследственности, как сейчас принято считать, то перед нами неизбежно встают новые вопросы. Как именно «закодированы» в молекуле ДНК эти наследственные особенности? Каким образом обеспечивается постоянство этого «кода» из поколения в поколение?

Генетический алфавит

Авторы модели ДНК представляют систему «кодирования» следующим образом: различные свойства ДНК в разных организмах объясняются различием в составе нуклеотидов в ее молекуле. Нуклеотиды, по их мнению, являются своего рода генетическим алфавитом, при помощи которого в ДНК «химическим почерком» закодированы наследственные особенности организма. А поскольку ДНК содержит по меньшей мере несколько тысяч нуклеотидов, возникают неограниченные возможности комбинаций во взаимном чередовании и порядке пар А – Т, Г – Ц в ее молекуле. Каждая новая комбинация придает новые свойства ДНК.

Молекулы ДНК в клетке, поясняют далее Дж. Уотсон и Ф. Крик, способны к «самовоспроизведению» (редупликации) с сохранением постоянного расположения нуклеотидов. Мы знаем, что внутренний «цилиндр» молекулы ДНК состоит из пар оснований А – Т и Г – Ц, соединенных между собой водородными связями. Редупликация молекул ДНК может идти следующим образом. Водородные связи между парными нуклеотидами на одном конце молекулы постепенно начинают прерываться и обе спиральные цепи ДНК «разматываются», освобождаясь друг от друга. Такая развернувшаяся цепь удерживается связями между остатками молекул дезоксирибозы и фосфорной кислоты, «выставив» перпендикулярно оси свои основания. В окружающей среде находятся синтезированные клеткой свободные нуклеотиды, которые могут входить в реакцию со свободными основаниями развернутой цепи ДНК. Но к каждому основанию может приблизиться и соединиться с ним только нуклеотид, имеющий парное, «дополняющее» основание. Это значит, что к развернутой цепи начнет присоединяться другая, недостающая цепь ДНК, причем точно такая, какая была в другой половине макромолекулы и отделилась, чтобы подобным же образом извлечь из среды то, чего ей недостает до полной молекулы ДНК. В результате этих процессов образуются две молекулы ДНК, каждая из которых имеет половину материнской молекулы, дополненную вновь синтезированной. Дочерние молекулы становятся, таким образом, точной копией материнской ДНК. При этом сохраняется и состав генетического материала.

Здесь мы должны, однако, предупредить читателя, что то, о чем он только что прочел, было всего-навсего гипотезой Уотсона и Крика о редупликации ДНК. Вы можете справедливо заметить, что правильность гипотез должна быть доказана экспериментально.

Описанную гипотезу подтвердил американский биохимик А. Корнберг, которому удалось открыть полимеразу ДНК – фермент, участвующий в процессе редупликации. Получив из клеток кишечных бактерий Escherichia coli ДНК и фермент, он соединил их в пробирке, добавив туда же смесь соответствующих нуклеотидов. Через некоторое время количество ДНК в пробирке значительно увеличилось, причем были использованы присутствующие в среде свободные Нуклеотиды. За свое открытие он получил в 1959 году Нобелевскую премию по физиологии и медицине. Эту премию разделил с ним профессор С. Очоа, открывший независимо от Корнберга фермент – полимеразу РНК, которая синтезирует рибонуклеиновую кислоту. Совсем недавно Корнберг обнаружил еще один фермент, участвующий в синтезе ДНК, и назвал его фосфатазой ДНК.

Модель редупликации молекулы ДНК. К развернутым цепочкам (вверху) присоединяются дополнительные цепочки того же состава, что и в материнской молекуле.

Гипотезу о редупликации ДНК подтвердили в 1958 году М. С. Месельсон и Ф. Сталь. Они культивировали бактерии Е. coli в жидкой питательной среде, содержащей вещества с радиоактивным азотом ¹⁵N. ДНК этих бактерий оказалась потом «меченной» радиоактивным элементом всюду, где в ее макромолекулах содержится атом азота. Затем ученые культивировали бактерии в жидкой питательной среде, содержащей нерадиоактивный азот ¹⁴N. При выращивании бактерии размножались, и можно было наблюдать, как радиоактивный азот ДНК равномерно распределялся по дочерним молекулам ДНК. В каждой последующей генерации бактерий отмечалась половинная радиоактивность ДНК по сравнению с предыдущей. Иначе говоря, при каждой редупликации ДНК радиоактивность материнской макромолекулы равномерно распределялась в двух дочерних макромолекулах, которые создавали недостающие им цепи, привлекая для этого нуклеотиды с нормальным азотом.