Текст книги "Рассказы о биоэнергетике"

Автор книги: Владимир Скулачев

сообщить о нарушении

Текущая страница: 9 (всего у книги 14 страниц)

Цитохромоксидаза

Протонный потенциал, приводящий в движение механизм синтеза АТФ, генерируется ферментами дыхания. Среди них наиболее изучена цитохромоксидаза, последний фермент дыхательной цепи. Цитохромоксидаза катализирует окисление восстановленного цитохрома с кислородом. При этом ион двухвалентного железа (Fe2+), входящий в состав цитохрома с, теряет электрон и превращается в ион трехвалентного железа (Fe3+). Ионы Н+, необходимые для образования воды, черпаются из внутреннего объема митохондрии:

4Fe2 + O2 + 4Н+внутр. → 4Fe2+ + 2Н2О.

Окисленный цитохром с восстанавливается вновь посредством предшествующего компонента дыхательной цепи – производного хинона (он называется убихинол, сокращенно QH2). Процесс происходит таким образом, что ионы Н+, выделяющиеся при этой реакции, остаются снаружи митохондрии:

2QH2 + 4F3+ → 2Q + 4Fе2+ + 4Н+наружн.,

где Q – окисленная форма убихинола, называемая убихиноном. Суммарная реакция окисления убихинола кислородом может быть записана так:

2QH2 + O2 + 4Н+внутр. → 2Q + 2Н2О + 4Н+наружн.

Регенерация QH2 из Q осуществляется в конечном итоге за счет атомов водорода, отщепляемого от карбоновых кислот в цикле Кребса.

Итак, один акт восстановления молекулы кислорода до воды, катализируемый цитохромоксидазой, приводит к выделению четырех ионов Н+ по внешнюю сторону митохондриальной мембраны и к поглощению четырех Н+ по внутреннюю ее сторону.

В простейшем варианте цитохромоксидазного механизма, предложенном в свое время Митчелом, разделение зарядов этим ферментом обусловлено тем, что окисление убихинола происходит на внешней поверхности мембраны, после чего электроны переносятся через мембрану и восстанавливают кислород на противоположной, внутренней, поверхности мембраны. Однако впоследствии молодым финским биоэнергетиком М. Викстремом были поставлены опыты, показавшие, что механизм может быть более сложным. По Викстрему, потребление молекулы кислорода цитохромоксидазой сопровождается выделением не четырех, а восьми ионов водорода снаружи митохондрий.

Цитохромоксидаза

Внешне опыт Викстрема выглядел весьма просто. К митохондриям добавляли восстановленный цитохром и измеряли кислотность среды. Оказалось, что среда закисляется, то есть митохондрии выделяют ионы Н+. Закисление исчезает, если создать бескислородные условия или отравить цитохромоксидазу цианидом.

Такой результат не объяснялся схемой цитохромоксидазы, рассмотренной Митчелом. Ведь цитохром с – донор электронов, окисление его железа (Fe2+) само по себе не может приводить к выделению ионов Н+. Чтобы свести концы с концами, Викстрем предположил, что цитохромоксидаза переносит через мембрану не только электроны, но и протоны, причем потоки этих заряженных частиц направлены в разные стороны: электроны движутся внутрь, а протоны – наружу.

У Митчела цитохромоксидаза играет давно известную для нее роль окислительного фермента – переносчика электронов с той лишь особенностью, что электроны переносятся поперек мембраны.

У Викстрема цитохромоксидаза выполняет сверх того еще и совсем другую функцию, действуя как протонный насос.

Митчел немедленно атаковал Викстрема, увидев в новой схеме ревизию своего механизма, который казался ему таким естественным.

Действительно, генерация протонного потенциала Митчеловой цитохромоксидазой есть прямое следствие химизма этого процесса. Если окисление убихинола и восстановление кислорода происходят по разные стороны мембраны, а цитохромоксидаза связывает эти две реакции, перенося через мембрану электроны, то прямым и неизбежным следствием такого процесса окажется накопление ионов Н+ снаружи митохондрий и их потребление внутри. Никакого специального устройства для генерации потенциала здесь не требуется. Достаточно уложить цитохромоксидазу поперек мембраны, как этот известный биохимикам уже 70 лет фермент автоматически становится генератором протонного потенциала.

С момента первой публикации хемиосмотической гипотезы Митчел и его сторонники всегда приводили цитохромоксидазу как наиболее наглядный пример фермента-генератора. И вот теперь, когда гипотеза Митчела в целом уже доказана, вдруг появляется вихрастый молодой парень из Хельсинки и заявляет в глаза основателю мембранной биоэнергетики:

– Ваш взгляд слишком упрощен. Цитохромоксидаза не только фермент, но и протонный насос!

Сначала Митчел третировал данные Викстрема как примитивный артефакт.

– Выделение протонов при окислении цитохрома с, – говорил он, – обусловлено взаимодействием продукта реакции с мембраной митохондрий.

В ответ на это возражение Викстрем заменил цитохром с искусственным донором электронов – ферроцианидом, который с мембраной не взаимодействует. Выделение Н+ сохранилось.

Тогда Митчел указал на другую возможность: не происходит ли в системе Викстрема окисление убихинола?

Викстрем возразил, что он обрабатывал митохондрии целым коктейлем ядов, которые должны были перекрыть все подходы к убихинолу. Чтобы окончательно отбросить возражение оппонента, Викстрем поставил опыты на цитохромоксидазных протеолипосомах, где убихинола вовсе не было. И вновь наблюдалось выделение ионов водорода. Правда, оно было меньше, чем в митохондриях, но уменьшение можно было легко объяснить разницей в размере митохондрий и протеолипосом (последние гораздо мельче).

– Что толку в объяснении? Эффект мал. Почему я должен в него верить? – высокомерно возразил Митчел.

Чтобы решить спор, я предложил Викстрему попытаться сделать большие протеолипосомы. Этот совет не вызвал у него энтузиазма.

– Большие протеолипосомы, конечно, лучше маленьких, но как их сделать большими?

Викстрему так и не удалось увеличить размер протеолипосом. Но совсем недавно эту проблему решил мелсиканец М. Монтал. Он приготовил цитохромоксидазные протеолипосомы диаметром в десять раз больше митохондрий. Теперь дело за Викстремом: если он прав, должно быть массированное выделение водородных ионов при окислении ферроцианида в протеолипосоодах-гигантах.

Ожесточенная дискуссия между Митчелом и Викстремом, не прекращающаяся и по сей день, последние несколько лет заметно оживляла обстановку на собраниях биоэнергетиков.

Совсем недавно наметилась неожиданная возможность почетного для обеих сторон разрешения затянувшегося спора. У одного из видов бактерий обнаружили необычную цитохромоксидазу, состоящую всего из двух белковых цепей (у митохондриального фермента их семь). По предварительным данным Г. Шаца из Швейцарии, эта «простая» цитохромоксидаза не закисляет среду при добавлении ферроцианида, хотя и образует протонный потенциал. Возможно, что этот фермент работает по Митчелу, а цитохромоксидаза митохондрий – но Викстрему. Можно предположить, например, что пять «лишних» белков митохондриальной цитохромоксидазы образуют протонные каналы, в то время как два белка, общих с ферментом из бактерии, отвечают за реакцию переноса электронов.

В этой связи надо указать на один момент, связанный с эффективностью цитохромоксидазного генератора. Схема Митчела при всей своей простоте страдает одним недостатком: КПД Митчеловой цитохромоксидазы менее 50 процентов. Механизм Викстрема сложнее, но зато почти вся энергия, выделяющаяся при окислительной реакции, используется для создания протонного потенциала.

Не исключено, что эволюция этой системы шла в направлении «от Митчела к Викстрему». Тогда бактерии с «простой» цитохромоксидазой используют примитивный (но, может быть, более устойчивый) механизм, а митохондрии – более сложную и совершенную систему.

Для окончательного решения этой проблемы необходимы детальные сведения об устройстве двух типов цитохромоксидаз.

Кое-что нам известно уже сегодня. Показано, что оба фермента содержат по два атома железа и по два атома меди, причем железо входит в состав тема, плоского органического макроцикла, подобного тому, что найден в гемоглобине крови. Именно атомы металлов участвуют в переносе электронов цитохромоксидазами. Для пяти из семи белков митохондриального фермента выяснена первичная структура, то есть последовательность аминокислот, составляющих белковую цепь. Для фермента из бактерий эта работа еще не начата.

Выяснена примерная топография фермента митохондрий (но не бактерий): показано, что некоторые из белков смотрят наружу митохондрий, другие внутрь, а третьи пронизывают мембрану насквозь. В целом цитохромоксидаза имеет вид буквы Y, причем «ножка» довольно сильно высунута из мембраны на внешней ее стороне, а кончики «рогов» чуть выдаются в воду с противоположной, внутренней стороны мембраны. К «ножке» лепится небольшой белок цитохром с.

Пространственная структура бактериального фермента неизвестна.

Ни для того, ни для другого фермента неясен путь электрона. Известно лишь, что электрон поставляется цитохромом с (Fe2+) на внешней поверхности мембраны. Затем он передается, как по эстафете, от одного атома железа или меди к другому вплоть до кислорода. Мы не знаем ни точной локализации атомов железа и меди в мембране, ни того места, где происходит восстановление кислорода. Загадкой остается и путь протонов, необходимых для образования воды при восстановлении кислорода.

Эта последняя проблема была исследована нашим сотрудником А. Константиновым. Он поставил ряд остроумных опытов, призванных ответить на' вопрос, изменяется ли характер взаимодействия цитохромоксидазы с протонами при появлении электрического поля на мембране митохондрий. Не вдаваясь в детали экспериментов, скажу лишь, что влияние поля было обнаружено. Оно оказалось таким, как если бы ионы Н+ транспортировались из внутреннего пространства митохондрий в толщу мембраны на некую глубину. По-видимому, именно там, в глубине мембраны, и происходит передача протонов на молекулу кислорода, получившую электроны от цитохромоксидазы.

Вот, пожалуй, и все то существенное, что можно сказать об устройстве цитохромоксидазного генератора. Как видно, ситуация здесь не многим отличается от той, в которой находятся исследования по АТФ-синтетазе: мы все еще далеки от создания точного чертежа этих загадочных преобразователей энергии.

Хлорофилльные генераторы

Цитохромоксидаза – пример фермента, генерирующего протонный потенциал за счет энергии, которая освобождается при окислительной реакции. Аналогичный механизм участвует также в преобразовании энергии при фотосинтезе.

Раньше под фотосинтезом понимали процесс образования сахара из углекислоты и воды с использованием энергии света. Однако развитие исследований в этой области за последние тридцать лет заставляет видоизменить такое определение фотосинтеза.

В начале 50-х годов было открыто фотофосфорилирование – синтез АТФ за счет энергии света в хлоропластах. Энергия АТФ у растений, как и у любых других живых организмов, может использоваться не только для синтеза углеводов, но также и для многих других целей.

Затем выяснилось, что усвоение света бактериями может протекать вообще без синтеза Сахаров, ограничиваясь образованием АТФ.

А в самое последнее время были описаны мутантные формы фотосинтезирующих бактерий, не образующих ни сахар, ни АТФ. В этом случае превращение энергии света обрывалось на стадии генерации протонного потенциала, который уже не мог использоваться для синтеза АТФ. Это не значит, однако, что протонный потенциал, а стало быть, и свет вовсе бесполезны для такой бактерии: они могли бы поддерживать транспорт веществ через мембрану, вращение жгутиков и другие потребляющие энергию протонного потенциала процессы.

Учитывая новейшие открытия биоэнергетиков, под фотосинтезом надо понимать не только синтез Сахаров, но также и любое другое использование энергии света для целей энергообеспечения живой клетки.

Универсальным биологическим преобразователем световой энергии служит фотогенератор протонного потенциала. Во всех известных сегодня случаях, кроме галофильных бактерий, фотогенератор улавливает свет молекулой пигмента хлорофилла (галофильные бактерии для этой цели используют ретиналь).

Хлорофилл – аналог тема, где вместо железа стоит атом магния. Хлорофилл всегда связан с особым мембранным белком. Хлорофилл-белковый комплекс составляет главный узел фотогенератора.

Более тридцати лет назад наш известный биохимик А. Красновский открыл важнейшее свойство хлорофилла – способность присоединять и отдавать электрон под действием света. Именно эти процессы, названные реакциями Красновского, как оказалось, лежат в основе работы белковых фотогенераторов, содержащих хлорофилл.

Рассмотрим одно из таких устройств – бактериальный хлорофилл-белковый комплекс. Это довольно сложный агрегат, состоящий из трех белковых цепей, четырех молекул хлорофилла, двух молекул феофитина (феофитин во всем подобен хлорофиллу, кроме одного – в нем нет магния). Сверх того, комплекс содержит убихинон, связанный с белком через атом железа.

Поглощение кванта света одной из молекул хлорофилла приводит к его немедленному окислению. При этом хлорофилл теряет один электрон, который присоединяется к другим компонентам комплекса: сначала к феофитину, находящемуся в непосредственной близости от хлорофилла, а затем к убихинону.

На этом завершается процесс разделения зарядов в комплексе: хлорофилл приобретает положительный заряд, возникший из-за потери электрона, в то время как убихинон, присоединивший этот электрон, заряжается отрицательно. Оба этапа процесса переноса электрона протекают чрезвычайно быстро: первый занимает менее 10-11 секунды, второй – порядка 10-10 секунды. Следующие этапы процесса – перенос электронов на свободный (не связанный с железом) убихинон и восстановление хлорофилла цитохромом с. На это уходит 10-55—10-3 секунды..

Присоединив два электрона, убихинон связывает также и два протона, превращаясь в убихинол. Протоны (ионы Н+) черпаются из цитоплазмы, поскольку восстановление убихинона происходит вблизи той поверхности бактериальной мембраны, которая обращена внутрь клетки. Убихинол диффундирует на другую, внешнюю сторону мембраны и отдает электроны окисленному ранее цитохрому с. Окисление убихинола приводит к освобождению ионов Н+ снаружи клетки.

В результате на каждый квант поглощенного света через мембрану переносится один ион Н+. Расчет показал, что КПД такой системы невысок – около 20 процентов. Однако бактериальная клетка располагает и другим, более сложным механизмом, когда на один квант переносится два водородных иона. Это сравнительно медленный процесс, включающий ряд промежуточных стадий с участием убихинона и цитохромов. Как предполагает В. Самуилов, два режима: быстрый, но менее эффективный и медленный, но экономичный – могут попеременно включаться в зависимости от условий существования бактериальной клетки.

До сих пор мы вели речь о фотосинтезе у бактерий. Давайте обратимся к аналогичному процессу в зеленых растениях. По существу, растительный фотосинтез есть усложненный вариант бактериального. Начальные стадии двух этих процессов совпадают: поглощение светового кванта хлорофиллом, фотоокисление хлорофилла (реакция Красновского), затем восстановление пластохинона (аналога убихинона) и его окисление цитохромом.

Пока что идет все как у бактерий. Но уже следующая стадия оказывается иной. Вместо возвращения электрона с цитохрома на окисленный ранее хлорофилл происходят два совсем других процесса.

Один из них – расщепление молекулы воды на кислород, ионы Н+ и электроны. Именно этими электронами и восстанавливается окисленный пластохиноном хлорофилл. Что же касается цитохрома, то его электроны переносятся на другую молекулу хлорофилла, которая, так же как и первая, предварительно поглотила квант света и окислилась в реакции Красновского. Электрон, отнятый от хлорофилла при поглощении этого, уже второго по счету, кванта, переносится к углекислоте длинной цепочкой ферментов, участвующих в синтезе углеводов. В конечном итоге поглощение двух квантов света двумя разными хлорофиллами вызывает перенос одного электрона от воды к углекислоте.

Не менее существен и другой результат – перенос двух ионов Н+ через мембрану хлоропласта, в которой локализованы хлорофилл-белковые комплексы фотосинтетического аппарата. Механизм этого процесса генерации протонного потенциала еще ждет своих первооткрывателей.

Если сравнить системы, использующие свет у бактерий и растений, можно убедиться, что протонный потенциал – единственный первичный продукт циклической фотосистемы бактериального типа, в то время как нециклический фотосинтез растений не только генерирует протонный потенциал, но и служит поставщиком электронов. Эти электроны отнимаются от воды и используются при синтезе Сахаров, из которых затем образуется крахмал. Тем самым фотосинтез растений выполняет функцию, противоположную той, которая присуща процессу дыхания: при фотосинтезе расщепляется вода, а образуются кислород и органические вещества. При дыхании органические вещества окисляются кислородом с образованием воды.

Накопив крахмал в течение дня, растительная клетка окисляет его ночью. В результате усвоенная клеткой энергия Солнца может использоваться круглые сутки. Это несомненное преимущество растения перед бактерией-фотосинтетиком, неспособной к расщеплению воды и синтезу крахмала.

Фотосинтез без хлорофилла

Биофизик Ю. Владимиров рассказал мне однажды, что лет двадцать назад академик А. Красновский спросил как-то своих учеников:

– Какой самый простой признак фотосинтеза?

– Присутствие хлорофилла, – дружно ответили его молодые коллеги.

Догма о хлорофилле как непременном участнике и главном действующем лице фотосинтеза продержалась в биологии ровно 60 лет: с момента открытия хлорофилла Р. Вильштеттером в 1913 году вплоть до 1973 года, когда были опубликованы результаты первых опытов Д. Остерхельта и У. Стокениуса о необычной энергетической системе одного из видов солелюбивых бактерий.

Фотосинтез без хлорофила

Как показали эти авторы, галофильная, то есть солелюбивая, бактерия Halobacterium halobium, живущая в насыщенном растворе хлористого натрия, закисляет среду при освещении, подобно тому как это делают фотосинтезирующие бактерии. Добавление разобщителя-протонофора полностью предотвращает закисление. Этот факт указывал на генерацию протонного потенциала.

Еще один вид бактерии-фогосинтетика? Допустим. Но есть ли у этого галофила хлорофилл?

Оказалось, что нет! Свет, вызывающий закисление среды, поглощался особым белком, похожим вовсе не на хлорофилл-белковые комплексы фотосинтезирующих бактерий и растений, а на зрительный пурпур, или родопсин, – белок, содержащийся в сетчатке глаза. Сходство пигмента солелюбивой бактерии и родопсина прежде всего в том, что и тот и другой представляют собой мембранные белки, окраска которых обусловлена остатком ретиналя (производного витамина А), присоединенного альдиминной связью к одной из аминокислот белковой цепи (к лизину).

Из-за сходства двух белков Остерхельт и Стокениус назвали свой пигмент бактериородопсином.

Открытию бактериородопсина суждено было сыграть совершенно особую роль в развитии биоэнергетики. Последовавшие затем события были столь значительными, что ниспровержение догмы о хлорофилле как обязательном участнике фотосинтеза (что само по себе, конечно, далеко не рядовое наблюдение) как-то отодвинулось на второй план.

Действительно, отсутствие хлорофилла у галобактерий – это исключение из правила, пусть первое, но все же исключение. Куда важнее, что бактериородопсин оказался примером совершенно нового типа генераторов протонного потенциала, простейшим в ряду подобных устройств и поразительно удобным для исследования.

Именно с бактериородопсином удалось поставить опыты, окончательно доказавшие справедливость хемиосмотической гипотезы Митчела (об этом мы уже рассказали в первой части книги). Более того, изучая бактериородопсин, мы проникли глубже в тайну механизма протонных генераторов. Вот почему этот небольшой белок необычных бактерий, занявших в общем-то не слишком важную экологическую нишу в биосфере, вот уже десять лет приковывает к себе внимание биоэнергетиков всего мира.

Чем же так замечателен бактериородопсин?

Прежде всего своей простотой. Такие протонные генераторы, как АТФ-синтетаза, цитохромоксидаза, хлорофилл-белковые комплексы, составлены из нескольких белковых цепей. Их молекулярная масса колеблется от 120 до 500 килодальтон. По существу, это сложные надмолекулярные агрегаты. Они столь велики, что не умещаются в мембране, далеко выдаваясь из нее в омывающую водную среду. В этой среде, а также в самой мембране есть множество других белков, причем некоторые из них образуют комплексы с белками-генераторами (связаны с ними в общих цепях и системах химических реакций или просто на правах ближайших соседей).

Бактериородопсин – это одна-единственная белковая цепь массой всего в 27 килодальтон. В мембране он занимает обширные участки, где нет других белков, а значит, и нет проблемы докучливых соседей, которые могут сопутствовать белку-генератору при его очистке. Да и сама процедура очистки до смешного проста: достаточно перенести галобактерии в воду из привычного для них насыщенного раствора поваренной соли, как связи между мембранными компонентами нарушаются и все содержимое клетки переходит в воду.

Все, кроме бактериородопсина. Области мембраны, занятые этим белком (так называемые фиолетовые бляшки), в воде не разрушаются из-за прочной кристаллической упаковки молекул бактериородопсина. Дело в том, что фиолетовая бляшка – это двумерный белковый кристалл, где молекулы бактериородопсина объединены в триады, а триады – в правильные шестиугольники.

Бляшки намного крупнее всех прочих компонентов смеси, которая на лабораторном жаргоне носит неблагозвучное название «шокат» (от слова «шок»; обработка клеток водой, ведущая к разрыву их оболочек, определяемая как осмотический шок). Достаточно отцентрифугировать эту смесь и промыть, как в ваших руках оказывается паста необычного фиолетового цвета, Определение химического состава пасты показывает, что она состоит на 7.5 процентов из бактериородопсина и на 25 – из фосфолипидов, заполняющих промежутки между молекулами этого белка. Других белков в пасте не обнаруживается, так что описанная выше нехитрая процедура дает 100-процентную очистку бактериородопсина от белковых примесей.

Те, кто сталкивался с необходимостью получить чистый фермент, могут оценить все преимущества работы с бактериородопсином. Почти всегда очистка фермента – это многостадийный процесс, каждый этап которого был когда-то подобран эмпирически методом проб и ошибок. По ходу очистки фермент может инактивироваться или изменить свои исходные свойства. Удаление примесных веществ часто далеко не безразлично для мембранного фермента, теряющего тем самым своих привычных партнеров по мембране. Все эти и подобные им проблемы просто не возникают, если вы имеете дело с бактериородопсином.

В довершение всего этот белок, как мы уже отмечали в одной из предыдущих глав, отличается чрезвычайной устойчивостью к повреждающим воздействиям: высокой температуре, кислотам, щелочам, фотоокислению и химическим окисляющим агентам. В холодильнике он может храниться годами без потери биологической активности.

Столь же стабильны фосфолипиды фиолетовых бляшек. Это простые эфиры фосфоглицерина и насыщенных жирных кислот с ветвящимися углеводородными цепями. Они гораздо устойчивей фосфолипидов обычных биологических мебран, содержащих лабильные (неустойчивые) сложноэфирные связи и какое-то количество ненасыщенных жирных кислот, подверженных перекисному окислению.

Стабильность бактериородопсина и его липидных партнеров обусловлена средой обитания бактерий: мало того, что Halobacterium halobium живет в насыщенной солевой смеси (соль в таких концентрациях противопоказана обычным формам жизни), так этот микроб еще к тому же и термофил, то есть любитель тепла. Засоленные озера в пустынях, выжженных тропическим зноем, – вот естественная среда обитания бактерий, содержащих бактериородопсин. Так стоит ли удивляться, что этот белок – одно из самых стабильных веществ белковой природы?

Одного не выносит бактериородопсин – удаления липида. Лишенный липидного компонента, бактериородопсин обратимо денатурирует – свойство, простительное мембранному белку, всегда окруженному жироподобными веществами мембраны. Но и здесь, в этом своем единственном требовании, бактериородопсин совсем не привередлив: можно заменить природный фосфолипид фиолетовых бляшек любым другим, и бактериородопсиновый генератор будет работать как ни в чем небывало.

Итак, бактериородопсин – самый простой и удобный для исследования биологический преобразователь энергии. Давайте же посмотрим, как он устроен. Может быть, хоть здесь мы отдохнем от множества неизвестных, сопутствовавших нам, когда мы вели речь об АТФ-синтетазе и других уже рассмотренных в этой книге генераторах протонного тока.

Но не спешите и не обольщайтесь до срока, читатель. Слов нет, бактериородопсин прост. Он состоит из ретиналя и полипептидной цепи умеренной длины. Белковая часть бактериородопсина построена из 248 аминокислотных остатков, образующих линейную последовательность. 19 типов различных аминокислот набраны в строго определенном, уникальном порядке, характерном только для бактериородопсина. Полученная таким образом цепь уложена неким, опять-таки единственным в своем роде способом в мембране бактерии.

Чтобы точно ответить на вопрос, как устроен бактериородопсин, мы должны знать пространственные координаты всех составляющих его атомов (а их около 4 тысяч!). Эта сложнейшая задача уже решена для ряда белков.

Работа такого рода складывается из нескольких этапов. Прежде всего определяют последовательность аминокислот в полипептидной цепи белка, отщепляя одну за другой составляющие цепь аминокислоты (для бактериородопсина с его 248 аминокислотами надо было бы произвести 247 таких операций).

Следующая проблема – как упакована полипептидная цепь? Она никогда не бывает вытянутой в нитку. Цепь образует петли, клубки, закручивается в спираль. Эту трехмерную пространственную организацию белковой молекулы исследуют путем рентгеноструктурного анализа. Кристаллы белка облучают пучком рентгеновских лучей и по отклонению рентгеновских лучей вблизи ядра того или иного атома определяют, в каком месте кристалла он расположен. Затем полученные результаты сопоставляют с данными по аминокислотной последовательности и строят модель молекулы белка.

Бактериородопсину суждено было стать первым мембранным белком, чью структуру удалось выяснить хотя бы в общих чертах. На этом пути пришлось преодолеть немалые трудности, поскольку все предшествующие исследования велись на водорастворимых белках, и именно для таких белков были разработаны методы определения аминокислотной последовательности и рентгеноструктурного анализа.

Чтобы расшифровать последовательность аминокислот в белке такого размера, как бактериородопсин, исходную полипептидную цепь расщепляют каким-либо способом в нескольких местах на куски и анализируют каждый из полученных фрагментов. Затем вновь обращаются к исходной цепи и расщепляют ее на куски, но уже другим способом. Вновь анализируют фрагменты цепи.

В такой работе вся надежда на то, что при первом и втором расщеплениях места разрывов цепи окажутся различными. Тогда место разрыва при первом расщеплении может оказаться в середине фрагмента, полученного при втором расщеплении, что позволит мысленно состыковать фрагменты и получить полную картину аминокислотной последовательности исходной цепи.

Два обстоятельства осложнили на первых порах работу, когда академик Ю. Овчинников и его коллеги взялись за расшифровку структуры бактериородопсина. Во-первых, белок, спрятанный в мембрану, очень устойчив к действию обычных протеолитических ферментов, применяемых для фрагментации полипептидных цепей. (Здесь стабильность бактериородопсина, пожалуй, в первый и последний раз обернулась против его исследователей.) Во-вторых, полученные в конце концов фрагменты прочно склеивались между собой (белок-то необычный – «жирный»: ведь место его прописки в клетке – гидрофобная мембрана).

Преодолев эти затруднения, химики оказались перед еще более сложной задачей: весьма протяженные участки цепи составлены, как выяснилось, из сходных или даже одинаковых гидрофобных аминокислот. Для дальнейшего анализа таких участков обычные методы не годились.

Исследование структуры белка – трудное и нескорое дело, особенно если речь идет о необычном объекте вроде бактериородопсина. Работу ведут в течение многих месяцев, а иногда и лет, и нет уверенности, что даже в случае удачи вам достанутся лавры первооткрывателя. Более счастливый конкурент может «обскакать» вас на самом финише работы и первым обнародовать аминокислотную последовательность. Тогда ваши результаты вряд ли примет к публикации серьезный научный журнал и долгий труд окажется напрасным.

Можно, конечно, публиковать аминокислотную последовательность белка по частям, по мере того как завершается расшифровка какого-нибудь крупного фрагмента белковой молекулы. Но и это далеко не безопасный путь, если вас волнует проблема приоритета, так как подобная публикация поможет вашему конкуренту, который уже расшифровал другие звенья цепи.

И тем не менее Ю. Овчинников пошел на публикацию частичной структуры бактериородопсина. Она появилась в одном из летних номеров «Записок Федерации европейских биохимических обществ» (ФЕБС Леттерз) за 1978 год. Ученый знал, что аналогичную работу ведет группа в Сент-Луисе, но, судя по поступающим оттуда сведениям, американцы явно отстали и уже не имели реальных шансов на успех.

Осенью 1978 года работа в Москве была закончена. Полная структура бактериородопсина опубликована в ноябрьском номере «Биоорганической химии» за 1978 год. А в январском номере «Трудов Академии наук США» за 1979 год появилось сообщение о частичной структуре бактериородопсина за подписью одного из самых знаменитых биохимиков нашего времени, индуса Г. Кораны, работающего в Америке. В свое время Корана был первым, кому удалось искусственно синтезировать ген, за что и получил Нобелевскую премию.

Мы давно знали, что Корана в какой-то мере изменил своим прежним интересам, увлекшись тайной устройств мембранных белков-генераторов. Но что делал Корана в новой для себя области, оставалось загадкой. Считалось, что он пытается применить свои выдающиеся способности химика-синтетика к проблеме получения меченных особым способом фосфолипидов, которыми можно было бы зондировать мембрану, погружая молекулы-зонды в ее гидрофобную фазу на разную глубину. Именно этому вопросу была посвящена единственная статья Кораны по мембранам, появившаяся в 1978 году.