Текст книги "Рассказы о биоэнергетике"

Автор книги: Владимир Скулачев

сообщить о нарушении

Текущая страница: 12 (всего у книги 14 страниц)

Глава 2. Электродвигатель, изобретенный бактерией

Флагелла, крюк и диски

Многие бактерии подвижны. Под световым микроскопом видно, что они активно перемещаются в пространстве: плывут со скоростью несколько микрон в секунду. Если использовать электронный микроскоп, то при максимальном увеличении можно разглядеть устройство двигательного аппарата бактерии.

Его наиболее крупная часть – это флагелла, или жгутик, – длинный тяж, состоящий из однотипных молекул флагеллина – особого, не растворимого в воде белка. Флагелла достигает несколько микрон в длину, то есть она длиннее тельца бактерии. Это как бы хвост микроба. Толщина флагеллы порядка 130 ангстрем.

Флагелла крепится к изогнутому на конце стержню («крюку»), который проходит сквозь внешнюю мембрану бактериальной клетки. Крюк, в свою очередь, прикреплен к М-диску, правильной формы структуре (в плане – круг, в разрезе – прямоугольник). Диаметр диска чуть больше 200 ангстрем, толщина около 30 ангстрем. М-диск погружен во внутреннюю (цитоплазматическую) мембрану бактерии.

Флагелла, крюк и диски

В межмембранном пространстве и в слоях клеточной стенки, расположенных снаружи цитоплазматической мембраны, находят еще три диска, укрепленных на стержне крюка. Стержень ориентирован перпендикулярно плоскости дисков и мембран.

Наблюдая в световой микроскоп движение кишечной палочки, обладающей многими жгутиками, можно заметить, что от одного из торцов цилиндрической клетки отходит вращающаяся спираль, ввинчивающаяся в воду. Это косичка из нескольких жгутиков, движение которых обусловливает движение бактерии.

Как же движутся жгутики? Вращаются или бьются о воду как хлыст? Чтобы ответить на этот вопрос, пришлось... поймать бактерию за «хвост». Да-да, ни больше ни меньше!

Суспензию бактерии, содержащую миллионы отдельных клеток в миллилитре, поместили в стакан миксера с металлическим пропеллером на дне. Включили миксер на некоторое время и затем посмотрели, что произошло с бактериями. Большинство из них осталось целыми, но лишилось «хвостов», которые лежали теперь отдельно от своих хозяев.

На следующем этапе работы жгутики выделили в чистом виде с помощью центрифугирования, а затем ввели в кровь кролику. Иммунная система кролика ответила на вторжение чужеродного компонента синтезом антител к флагеллину – белку жгутиков. Потом такие антитела получили из крови и химически «еришили» к стеклу.

Антитела, как известно, способны прочно связывать тот белок, против которого они были образованы. Этим-то свойством и воспользовались исследователи. На предметное стекло, покрытое антителами, нанесли капельки жидкости с бактериями и стали терпеливо ждать, пока какой-нибудь «невезучий» микроб коснется своим жгутиком поверхности стекла.

Вот одна из бактерий приблизилась к стеклу, но внезапно изменила направление движения и поплыла в другую сторону. Вот другая появилась в опасной зоне. И снова в последний момент ушла от опасности. Третья атаковала стекло в лоб, немедленно изменила направление движения и поймалась! Видно было, что бактерия вращается на одном месте, привязанная к стеклу невидимой нитью.

А. Глаголеву, проделавшему похожий опыт в нашей лаборатории, удалось «поймать» асимметричную по форме бактерию, напоминавшую своим видом полумесяц. Прикрепилась она к стеклу так, что к наблюдателю была обращена ее сутулая «спина». Видно было, что бактерия все время вращается вверх «спиной», не показывая своей впалой «груди». Это возможно только при условии, что происходит истинное вращение тельца бактерии относительно прикрепленного к стеклу жгутика.

Поразительно, как пойманная бактерия решила проблему освобождения из плена. Бактерия не ящерица, она не умеет отбрасывать попавший в ловушку хвост. Она выбрала иной путь к спасению. Через 40 минут безуспешных попыток вырваться на волю наша бактерия... разделилась пополам. Из двух новых клеток одна осталась привязанной к стеклу, а другая освободилась и тотчас уплыла подальше от опасной зоны.

Вернемся, однако, к устройству двигателя, изобретенного бактериями, благо здесь нас ждут свои чудеса.

Итак, опыт с «привязанной» бактерией однозначно доказал, что происходит вращение жгутика. Но что за еила заставляет его вращаться?

Отвлечемся на момент от бактерий и обратимся к более высокоорганизованным формам живых существ, также движущихся с помощью жгутиков. Вот, например, сперматозоид/Источник энергии, используемый его двигательным аппаратом, давно уже не составляет секрета. Это АТФ, гидролизуемый сократительным белком – АТФазой, близким по свойствам к тому, который содержится в мышцах и тоже использует "нергию АТФ для совершения механической работы.

Распад АТФ приводит в движение жгутик сперматозоида. Так, может быть, и жгутик бактерии вращается за счет энергии АТФ?

Стали искать сократительные белки – АТФазы у бактерий и в конце концов нашли. Правда, флагеллин, белок бактериального жгутика, не относится к их числу. Все попытки принудить флагеллин к гидролизу АТФ окончились полной неудачей. Но может быть, АТФаза сидит где-то в других частях «мотора», например в дисках? Однако и это предположение пока не подтвердилось.

А стоит ли вообще проводить какие-то аналогии между флагеллами бактерий и жгутиками высших? Ведь бактериальная флагелла гораздо мельче, да и устроена она несравненно проще: это тяж из структурного белка флагеллина, не обладающего какой-либо каталитической активностью. Жгутик сперматозоида гораздо более сложное образование: внутри мембранного чехла одиннадцать трубочек, вытянутых вдоль длинной оси жгутика, есть там сократительные белки и целое хозяйство ферментов.

Ну что ж, давайте откажемся от гипотезы относительно общности механизмов движения бактерии и сперматозоида, но не рискуем ли мы в этом случае вовсе остаться без гипотезы? Ведь все известные до сего времени механизмы биологической подвижности основывались на использовании энергии АТФ сократительными белками.

Протонный потенциал движет бактерией

В 1956 году, то есть за пять лет до публикации своей знаменитой гипотезы, Митчел напечатал заметку о возможных механизмах движения флагеллярных бактерий. Один из них мы опустим за ненадобностью (он казался фантастичным и оказался таковым). Но вот другой Митчелов вариант лег в основу нашей рабочей гипотезы спустя «каких-то» 18 лет.

Митчел обратил внимание на то, что «кирпичи» флагеллина в бактериальном жгутике уложены таким образом, что в поперечном сечении жгутик имеет вид толстостенной полой трубки. Что, если, подумал Митчел, эта трубка – гигантский канал, ведущий из бактерии во внешнюю среду? По такому каналу можно было бы, например, выпускать из бактерии ионы К+, которые каким-то образом аккумулируются бактерией, поступая внутрь клетки через всю ее поверхность. А может быть, это канал для входа в клетку ионов Н+ (!), откачивающихся через клеточную поверхность? По Митчелу, в любом из этих случаев вдоль наружной поверхности клетки должен возникать ток ионов, который мог бы приводить в движение бактерию.

Протонный потенциал движет бактерией

В 1974 году Дж. Адлер и его сотрудники опубликовали в США работу по движению мутанта кишечной палочки, лишенного способности синтезировать АТФ за счет дыхания. У мутанта включение дыхания никак не влияло на количество АТФ, который образовывался исключительно за счет брожения. Казалось, дыхание идет на холостом ходу и бесполезно для клетки. К своему удивлению, авторы статьи обнаружили, что это «холостое» дыхание способно поддерживать движение мутантной бактерии.

Они удивились еще больше, когда измерили скорость движения бактерий, обработанных арсенатом. Такая обработка снижала количество АТФ в клетке до практически неизмеримого уровня. И тем не менее лишенные АТФ бактерии отлично двигались, если в среде был кислород и протекал процесс дыхания.

Остановить бактерии удалось, добавив протонофор.

Авторы заключили, что непосредственным источником энергии для движения бактерий служит не АТФ, а какой-то другой компонент, образуемый дыханием. («Промежуточный продукт окислительного фосфорилирования», – писали Адлер и его коллеги, не искушенные в премудростях хемиосмотической гипотезы.)

В то время концепция протонного потенциала была далеко не общепринятой даже в кругу биоэнергетиков. Поэтому вряд ли стоит удивляться, что микробиолог Адлер сформулировал свой вывод в рамках старой схемы, предполагавшей существование каких-то особых химических соединений, образуемых дыханием и потребляемых АТФ-синтетазой.

Однако для меня тогда уже было ясно, что у этих двух систем есть только один общий продукт – протонный потенциал. Стало быть, мутант кишечной палочки, исследованной американскими микробиологами, образовывал за счет дыхания протонный потенциал, который, по-видимому, и служил источником энергии для движения бактериальной клетки. Именно такое толкование опытов Адлера я предложил, выступая летом 1975 года на очередном съезде европейских биохимиков.

В подтверждение своей правоты я привел данные опытов, поставленных А. Глаголевым на пурпурной фотосинтезирующей бактерии. Испытывая различные комбинации ферментных ядов и разобщителей-протонофоров, Глаголев показал, что скорость движения микроба пропорциональна величине протонного потенциала, а не количеству АТФ. Это был важный шаг вперед по двум причинам.

Во-первых, стало ясно, что эффект Адлера не есть некое исключительное свойство или следствие «уродства», присущее одному только мутанту кишечной палочки. Скорее это характерная черта дыхательного аппарата бактерий вообще, поскольку она проявляемся и у мутанта кишечной палочки, и у столь отдаленного в эволюционном отношении вида, как пурпурная бактерия-фотосинтетик, причем нормальный, а не мутантцый штамм. Существенно, что в качестве исходного энергетического ресурса для движения эти бактерии в отличие от кишечной палочки использовали свет, а не дыхание.

Во-вторых, Глаголев не в пример Адлеру «знал, где искать»: он мерил не только АТФ и скорость движения, но и мембранный потенциал. Обнаруженная им линейная зависимость между скоростью движения и потенциалом явилась сильным доводом в пользу нашей рабочей гипотезы.

Тем не менее нужен был прямой эксперимент. И он был вскоре поставлен.

Мы рассуждали таким образом. Если свет у нашей бактерии (или дыхание у кишечной палочки) нужен для движения только постольку, поскольку за их счет генерируется протонный потенциал, то можно получить подвижность и в отсутствие света (или дыхания), создав этот потенциал искусственно. Как это сделать?

Прежде всего необходимо перекрыть все пути образования протонного потенциала белками-генераторами. Затем к таким неподвижным уже бактериям надо добавить, например, кислоту, но не столько, чтобы, избави бог, их убить, а небольшое количество, которое просто создало бы некоторую избыточную концентрацию ионов водорода во внешней среде по сравнению с цитоплазмой бактериальной клетки. Поскольку в обычных условиях протонные генераторы бактерий откачивают ионы Н+ из клетки во внешнюю среду, то добавка кислоты должна имитировать включение генераторов.

С нетерпением я ждал результата этого опыта. Исполнится ли удивительное предсказание гипотезы: очнутся ли от паралича бактерии, отравленные целым коктейлем ядов, если в среду просто добавить немного соляной кислоты?

Опыт такого типа называют «острым». Гипотеза, положенная в основу острого опыта, выбирает из множества один-единственный вариант ответа системы на предполагаемое воздействие. Бактерии неподвижны из-за нехватки энергии. Так почему бы не добавить к ним АТФ – энергетический ресурс всех уже известных механизмов биологической подвижности? Или какой-нибудь другой нуклеозидтрифосфат, пирофосфат, фосфоэнолпируват, ацетилфосфат, ацетилкофермент А, то есть вещества, известные своей способностью оплачивать энергозатраты на отправление определенных биологических функций? А если уж менять рН среды, то почему добавлять кислоту, а не щелочь?

Из всех этих возможностей гипотеза «протонного мотора» прямо указывала на одну. «Добавь кислоты, и они задвигаются!» – подсказывала гипотеза Глаголеву, наблюдавшему в микроскоп обездвиженные бактерии. Они беспомощно броунировали в капле ядовитого раствора, как если бы это были не живые существа, а крупинки китайской туши. Рядом, на том же предметном стекле, – капелька кислоты. Глаголев осторожно смешивает две капли. Что это? Поплыла одна, другая, третья – и вот уже во всем поле зрения появились подвижные бактерии, проворно и как-то деловито, осмысленно снующие в самых различных направлениях.

Удача? А может быть, капля кислоты просто разбавила яды?

Опыт повторяется, но вместо кислоты берется капелька воды. Нет эффекта: бактерии по-прежнему неподвижны. Еще один контроль: вместо кислоты добавляется щелочь. Эффекта нет и в этом случае.

А вдруг кислота разрушила какой-то из ядов? Это крайне маловероятно: ведь изменение кислотности среды в общем-то невелико. И тем не менее...

В работе с такой сложной системой, как живое существо, пусть даже мельчайшее, одноклеточное, всегда можно найти несколько объяснений любому факту. Однако стоящая гипотеза тем и хороша, что она не только объясняет старые факты, но и предсказывает новые. Именно так было установлено, что подвижность возвращается при добавке кислоты к отравленным ядами бактериям.

Что же, отправимся дальше по пути, указанному гипотезой. Легко сообразить, что движение, вызванное кислотой, должно быть явлением временным. По мере поступления ионов водорода в бактерию кислотность внутри клетки должна повышаться, так что в конце концов внутри станет так же «кисло», как снаружи. Это значит, что протонный потенциал рассеется и бактерия остановится.

Известно, что время, необходимое, чтобы уравнялись концентрации ионов Н+ между бактерией и средой, измеряется несколькими минутами. Значит, вызванное кислотой движение должно прекратиться спустя минуты.

И действительно, через три минуты после добавки кислоты поле под микроскопом являло собой печальную картину, которую мы наблюдали в начале опыта: бактерии были неподвижны.

Вот вам и разрушение яда кислотой! Что же это он сначала разрушился, а потом, когда кислота проникла в клетку, опять образовался?

Конечно, нет.

А может быть, вообще клетка становится неподвижной, когда цитоплазма подкислилась?

Все может быть. Но заметьте, каждый следующий факт, предсказанный нашей гипотезой, требует от оппонента какого-нибудь нового предположения. Наша точка зрения ведет к новым фактам, противоположная – к новым предположениям.

И все же проверим, как влияет сама по себе кислотность среды на движение бактерий. Исключим из среды яд, мешавший производству протонного потенциала за счет света, и посмотрим, не обездвижутся ли бактерии при подкислении среды. Оказывается, этого не происходит. В подкисленной среде бактерии весело плавают до тех пор, пока не выключишь свет.

Итак, к чему же мы пришли? Протонный потенциал движет бактерией. Но как? Есть только один путь: ионы Н+ входят в бактерию и «походя» вращают М-диск, а с ним и всю флагеллу. Почему ионы Н+ идут внутрь клетки? Да просто потому, что их снаружи больше, чем внутри. Ведь не зря же мы добавили НС1, которая в воде полностью диссоциирует на Н+ и Сl-.

Если все это так, можно включить механизм движения и другим способом: создать, например, внутри клетки избыток отрицательных зарядов. Тогда даже при равенстве концентраций ионов Н+ внутри и снаружи клетки эти ионы будут поступать внутрь за счет электрических сил, перемещаясь от плюса к минусу.

Сказано – сделано! На стекле две капли. В одной неподвижные, отравленные ядовитой смесью бактерии, в другой еще один яд, антибиотик валиномицин. Этот агент резко повышает проницаемость мембран для ионов калия (К+).

Раствор валиномицина, как и среда с бактериями, не содержит ионов К+. В то же время внутри бактерий много этих ионов. Если теперь слить две капли, то валиномицин атакует бактерии, повысит их калиевую проницаемость и разрешит ионам К+ выйти из бактерии, где их избыток по сравнению с окружающим раствором.

Выходя, ионы К+ зарядят внутренность клетки отрицательно, этот минус притянет К+, и, двигаясь внутрь, Н+ запустит протонный мотор. Бактерии поплывут. Таково предсказание гипотезы.

А что получилось в опыте на самом деле? Бактерии задвигались и вновь через положенное время, когда уравнялись концентрации К+ внутри и снаружи клетки, остановились.

Предвидя новое возражение оппонента (а вдруг валиномицин работал у нас не переносчиком калия, а кем-то еще), мы поставили контрольный эксперимент, где бактерии находились в среде с высоким содержанием калия. Теперь калия было много и внутри и снаружи клетки. В таких условиях валиномицин не включал механизма подвижности. Эффект валиномицина (а также и кислоты) можно было снять и другим способом: добавив в среду разобщитель-протонофор и тем самым сведя к нулю протонный потенциал.

Наши данные по движению пурпурных бактерий были опубликованы у нас в «Биохимии» и за рубежом – в «Нэйчер», Вскоре появились сообщения из США и Японии, где аналогичные результаты получились в опытах на стрептококке и Bacillus subtilis. Параллельно мы проделали такую же работу с классическим объектом микробиологов – кишечной палочкой.

А совсем недавно Т, и А. Глаголевыми и М. Гусевым и К. Никитиной было доказано, что нитчатые сине-зеленые водоросли также используют протонный потенциал для своего скользящего движения по поверхности твердого субстрата.

Это последнее наблюдение свидетельствует, что протонный мотор, однажды изобретенный природой, применяется не только у бактерий, имеющих жгутики. У сине-зеленых водорослей жгутиков нет. Их роль выполняют, по-видимому, фибриллы, лежащие между внешней и цитоплазматической мембранами этих организмов, Сине-зеленые водоросли относятся к царству бактерий (у них есть даже другое название – цианобактерии). А могут ли организмы, принадлежащие к высшим царствам живой природы, двигаться за счет протонного потенциала? Чтобы ответить на этот вопрос, мы занялись движением хлоропластов.

Вращение хлоропластов

В тридцатые годы прошлого века французская академия получила от некоего мсье Донне удивительное сообщение. Корреспондент писал, что им обнаружено вращательное движение каких-то частиц в капле протоплазмы, выдавленной из харовой водоросли. Вращение, направленное в одну и ту же сторону, можно было наблюдать под микроскопом в течение многих минут, причем все это время его скорость оставалась постоянной (примерно один оборот за одну-две секунды).

Академия, осаждаемая изобретателями вечных двигателей, не решилась опубликовать заметку Донне. Создали комиссию для проверки поразительного эффекта. Наблюдение полностью подтвердилось. Доклад комиссии опубликовали в «Академических трудах» в 1838 году, после чего то ли Донне проявил настойчивость, то ли сами академики спохватились, но так или иначе заметка этого автора наконец увидела свет в одном из следующих выпусков тех же «Трудов».

Вращение хлоропластов

В те далекие времена биология что ни год приносила поистине великие открытия. Поэтому неудивительно, что эффект Донне, абсолютно непонятный по своей природе, прочно забыли, с тем чтобы вновь открыть по крайней мере дважды в течение следующих 140 лет.

Новые исследователи загадочного эффекта выяснили, что частицы, вращающиеся в каплях протоплазмы харовой водоросли, не что иное, как хлоропласты, содержащие хлорофилл органеллы высших растений (о хлоропластах шла речь выше, в главе, посвященной преобразованию энергии света в растительных клетках).

Но почему, за счет каких сил вращаются хлоропласты? Немногочисленные специалисты-цитологи, занимавшиеся этой экзотической проблемой лет двадцать-тридцать назад, считали, что вращение хлоропластов имеет ту же природу, что и так называемый циклоз – круговое движение протоплазмы в клетках харовых водорослей. Энергия для циклоза доставляется АТФ, который расщепляется особыми ворсинками, обращенными внутрь гигантской клетки харовой водоросли. Биение этих ворсинок движет протоплазму и, как думали цитологи, вращает хлоропласты.

Меня давно занимала проблема происхождения хлоропластов и митохондрий. Существует гипотеза, что и те и другие органеллы произошли из бактерий, когда-то захваченных более крупной клеткой гриба или протиста, например, какой-нибудь амебы. Действительно, у хлоропласта много общих черт с цианобактерией, а у митохондрии с некоторыми видами дышащих бактерий.

Так, может быть, механизм вращения хлоропластов устроен как у бактерий: по типу протонного мотора?

Е. Моценок, приехав к нам на стажировку из лаборатории Д. Стома, что в Иркутске, захватила с собой байкальские водоросли рода нителла. Как выяснилось, такой объект вполне пригоден для изучения эффекта Донне. Когда я впервые увидел своими глазами это явление, меня прежде всего поразило сходство вращающегося хлоропласта и «пойманной за хвост» бактерии, о которой шла речь в предыдущей главе. Но, может быть, мы столкнулись здесь со случайным, внешним подобием?

Моценок провела подробнейший анализ вращения хлоропластов с точки зрения энергетики этого процесса. Она наблюдала за хлоропластами в специальный микроскоп, используя инфракрасный свет для освещения объекта. Такой свет не поглощается хлорофиллом и не может быть использован энергетической системой хлоропластов.

В раствор был добавлен яд, отравляющий протонную АТФ-синтетазу, чтобы блокировать взаимопревращение энергии между протонным потенциалом и АТФ. В таких условиях вращения не обнаруживалось. Включение белой подсветки «заводило» вращение. Движение хлоропласта исчезало вновь спустя примерно минуту после выключения подсветки.

Вращение прекращалось при введении веществ, тормозящих генерацию протонного потенциала на мембране хлоропласта или снижающих уже образованный потенциал. Так действовали диурон, прерывающий перенос электронов при фотосинтезе, протонофоры, а также ионы аммония, уменьшающие трансмембранную разность концентраций водородных ионов – главную составляющую протонного потенциала хлоропластов.

Зато арсенат, вызывающий истощение запаса АТФ, не влиял на вращение хлоропластов. Оно не тормозилось также цитохалазином, ингибитором всех известных внутриклеточных движений, поддерживаемых энергией АТФ.

Все эти факты свидетельствуют, что хлоропласты используют для своего вращения протонный потенциал. Значит, в них есть протонные моторы?

Где находятся эти моторы, как они устроены, есть ли жгутики у хлоропластов, – все эти вопросы еще ждут своего решения. Что касается биологической функции двигательного аппарата хлоропластов, то она, по-видимому, может состоять в следующем. В гигантских клетках нителлы или харовой водоросли есть очень большое количество хлоропластов, которые плотно упакованы в многослойные образования, занимающие большую часть клетки между оболочкой и свободной частью цитоплазмы. Свободная цитоплазма находится в движении, которое поддерживается биением мельчайших ворсинок, обращенных в просвет цитоплазмы. Это движение способствует перемешиванию внутриклеточного содержимого. Когда сахара, образующиеся при фотосинтезе в хлоропластах, достигают свободной цитоплазмы, они увлекаются ее током и тем самым становятся достоянием всей клетки.

Но как сахарам добраться до свободной цитоплазмы? Вряд ли здесь можно рассчитывать на конвекцию: слишком уж узки щели между хлоропластами.

Хлоропласты в клетке неподвижны: они зажаты своими ближайшими соседями. Поэтому протонные моторы хлоропластов должны на первый взгляд работать вхолостую: вращать жгутики или фибриллы без всякого перемещения хлоропласта в пространстве. Но, может быть, именно это и есть их функциональный режим: например, жгутик, вращаясь, перемешивает жидкость в щелях между хлоропластами и ускоряет таким способом перемещение Сахаров из хлоропластов в свободный слой цитоплазмы. Не будь такого механизма, именно этот этап – от хлоропласта до свободной цитоплазмы – лимитировал бы весь процесс транспорта Сахаров в клетках водорослей.

В рамках такой гипотезы вращение хлоропластов в выдавленных каплях протоплазмы есть просто артефакт, связанный с освобождением отдельных хлоропластов из плена, в котором они находились внутри клетки.

Так или иначе, выяснение того обстоятельства, что хлоропласты располагают какими-то протонными моторами, свидетельствует о достаточно широком распространении в природе такого рода устройств, первоначально обнаруженных у флагеллярных бактерий.