Текст книги "Рассказы о биоэнергетике"

Автор книги: Владимир Скулачев

сообщить о нарушении

Текущая страница: 4 (всего у книги 14 страниц)

Хемиосмотическая гипотеза

На, чем же мы споткнулись? На том, что мембраны – негодный барьер для воды, продукта дыхания и фосфорилирования. Но из чего получается вода, например, при фосфорилировании? Из иона водорода (Н+), отнятого от АДФ, и гидроксила (ОН-), отнятого от фосфата. Так ведь Н+ и ОН– – заряженные частицы, ионы, а для ионов мембраны, как правило, практически непроницаемы!

Химиосмотическая гипотеза

Итак, нам нужно, чтобы при синтезе АТФ получались не вода, а ионы Н+ и ОН-, да еще; по разные стороны мембраны.

Если бы теперь дыхание тоже образовывало не воду, а Н+ и ОН-, то можно; было бы так расположить ферменты в мембране, чтобы при дыхании ион Н+ выделялся слева от мембраны, а при фосфорилировании – справа от нее. Тогда окажется, что дыхание образует слева от мембраны кислоту, справа – щелочь, а процесс форфорилирования просто-напросто нейтрализует кислоту и щелочь!

Таким образом, реакция нейтрализации кислоты и щелочи, образованных дыханием, станет движущей силой процесса синтеза АТФ.

Чтобы завершить строительство «интеллектуального собора», – остается лишь догадаться, как именно дыхание образует кислоту и щелочь.

Известно, что окисление субстратов дыхания кислородом катализируется дыхательными ферментами. Они бывают двух типов, Одни присоединяют атомы водорода, другие присоединяют электроны. Если окислить донор водорода (AH2) ферментом – акцептором электронов (С), то одним из продуктов реакции окажутся ионы Н+:

AH2 + 2C → A + 2Ce– + 2H+

Если теперь восстановить кислород посредством Се-, то произойдет потребление ионов Н+:

2Ce– + O + 2H+ → 2C + Н2O.

Вот мы и свели концы с концами!

Такова хемиосмотическая гипотеза Митчела. Oна схематично изображена на рисунке.

Oкисление субстрата АН2 (реакция 1) ферментом – акцептором электронов, который не указан, чтобы не усложнять схему, происходит на левой поверхности мембраны. В результате электроны присоединяются к ферменту, а протоны уходят в воду.

Затем электроны переносятся ферментом на правую сторону мембраны и там восстанавливают молекулярный кислород или какой-нибудь другой акцептор водорода (в общей форме обозначен буквой В). Вещество В, присоединив электроны, связывает ионы Н+ справа от мембраны, превращаясь в ВН2.

Синтез АТФ (реакция 2) происходит таким образом, что два иона Н+ отщепляются от АДФ и фосфата справа от мембраны, компенсируя потерю двух Н+ при восстановлении вещества В. Один из кислородных атомов фосфата переносится на другую сторону мембраны и, присоединив два иона Н+ из левого отсека, образует ШО. Остаток фосфорила присоединяется к АДФ, давая АТФ.

По схеме Митчела, показанной на рисунке, роль дыхания в синтезе АТФ ограничивается созданием избытка Н+ на одной стороне мембраны по сравнению с другой ее стороной. Дыхание как бы сгущает, концентрирует ионы Н+ в одном из двух отсеков системы, разделенных мембраной. Это означает, что оно совершает осмотическую работу. Затем осмотическая энергия, накопленная в виде разности концентраций ионов Н+ между левым и правым отсеками, расходуется на химическую работу, то есть на синтез АТФ.

Вот почему Митчел назвал свою схему «хемиосмотической гипотезой». Она выгодно отличается от старой, «химической» схемы, приведенной на странице 36, по крайней мере в одном своем аспекте. Митчел обошелся без неуловимых промежуточных продуктов вроде АН2 • фермент, А • фермент и А • фосфат. Ему вообще не нужны были какие-либо специальные продукты, общие для реакций дыхания и фосфорилирования. По Митчелу, связующим звеном двух процессов служат водородные ионы.

Итак, хемиосмотическая гипотеза освободилась от одного из недостатков старых схем. В то же время она объяснила два ранее непонятных момента: необходимость мембран и механизм действия веществ-разобщителей.

Совершенно очевидно, что устройство, придуманное Митчелом, нуждается в двух пространствах, разделенных мембраной, непроницаемой для ионов Н+ и ОН-. Любое нарушение изолирующих свойств мембраны, например повышение ее проницаемости для Н+, то есть протонной проводимости, должно подавлять процесс синтеза АТФ. Что касается дыхания, то при повышении проводимости оно ускорится, так как перенос водорода и электронов, уже не приводящий к накоплению энергии, «покатится под гору», превращая всю энергию дыхания в тепло.

Так ведь это же и есть разобщение дыхания и фосфорилирования: тот самый феномен, над объяснением которого бились авторы «химических» гипотез, заставляя динитрофенол уподобиться фосфату в реакции с ферментом!

Митчел обратил внимание на то, что все разобщители – растворимые в жирах слабые кислоты, имеющие в своем составе обратимо связывающийся протон. Так возникло предположение, что разобщители служат переносчиками протонов через мембрану. Они связывают Н+ на той ее стороне, где дыхание создает избыток ионов водорода, затем диффундируют, неся лишний протон, через мембрану, и освобождают Н+ в противоположном отсеке, где водородные ионы в дефицит

Корни гипотезы

Пожалуй, только два факта (оба негативного свойства!) были положены Митчелом в основу его гипотезы в далеком уже 1961 году. Это невозможность найти химические продукты, которые были бы общими для дыхания и фосфорилирования, и необъяснимость роли мембран и действия разобщителей в рамках традиционных представлений, почерпнутых из аналогии с брожением.

Однако было бы ошибочным полагать, что хемиосмотическая гипотеза возникла совсем уж на пустом месте. Еще в 1945 году швед Г. Лундегард писал о возможности образования кислоты и щелочи мембранными окислительными ферментами. Лундегард был первым, кто «уложил» дыхательный фермент поперек мембраны, увидев в этом механизм концентрирования ионов. В 40-е годы эту гипотетическую концепцию подхватили И. Конвей и Т. Брейди, стремившиеся таким способом объяснить механизм образования кислоты в желудке. В начале 50-х годов ту же мысль обсуждали в Англии Р. Деви, А. Огстон и Г. Кребс (тот самый Кребс, имя которого увековечено на карте обмена веществ в связи с циклом карбоновых кислот). В 1960 году известный биохимик Р. Робертсон, избранный впоследствии президентом Академии наук Австралии, писал о разделении зарядов как о первичной стадии получения энергии, необходимой для синтеза АТФ.

Однако все эти предположения существовали сами по себе, разрозненно, их авторы не пытались создать единую схему, признанную объяснить механизм превращения энергии в митохондриях. Выдвинув гипотезу о разделении Н+ и ОН– при синтезе АТФ, Митчел заполнил недостающее звено, замкнул «протонный цикл» и создал непротиворечивую концепцию, позволяющую понять природу сопряжения между дыханием и фосфорилированием.

Одна из многих гипотез?

в 1961 году схема Митчела в краткой форме была тотчас напечатана журналом «Нейчер» (трудности с публикациями возникнут позже!).

Новую концепцию восприняли первоначально как еще одно умозрительное предположение в длинном ряду биоэнергетических гипотез. В начале 60-х годов была большая мода на эти гипотезы. Поскольку речь шла о главных системах энергообеспечения живых клеток, ясно было, что победителя ждет хороший приз, и каждый уважающий себя биоэнергетик спешил выдвинуть собственную схему энергетического сопряжения. Гипотезы возникли и, не выдержав испытания опытом, гибли, чтобы уступить место новым предположениям.

Некоторые из них казались столь фантастичными, что не удостаивались проверки: никто не спешил вкусить сомнительного вида плод, и он, перезрев, падал и исчезал в «быстром и мутном потоке информации». Это случалось прежде всего тогда, когда сам автор гипотезы не делал попытки проверить предсказательную силу своих постулатов.

Поначалу казалось, что такая судьба уготована и хемиосмотической теории. Шли годы, а Митчел все молчал. Прошел даже слух, что он вовсе удалился от дел.

Глинн Хауз. Ослы и дети

Митчел действительно не ставил опыты по проверке своей концепции. Вскоре после первой публикации гипотезы он тяжело заболел и решил оставить работу в университете, с начальством которого у него всегда были нелады. Он покинул Эдинбург и на деньги, только что полученные по наследству, купил ферму на самом юге Англии, в медвежьем (по английским понятиям) углу, в нескольких милях от маленького городка Бодмин, графство Корнуэлл. Эти места известны нам по Конан Дойлу («Собака Баскервиллей»): Бодмин расположен чуть к югу от тех мрачных болот, где произошли захватывающие события с участием Шерлока Холмса. Научных учреждений в этих краях нет, зато сохранились легенды о пиратах, избравших окрестности Бодмина местом своего последнего прибежища на английских островах.

Прежний владелец фермы, получив причитавшуюся ему сумму, поспешил удалиться, оставив Митчелу стадо коров, которых доктор философии вынужден был доить собственноручно, чтобы предотвратить их страдания.

На территории фермы находились развалины старинного дома, принадлежавшего во времена наполеоновских войн британскому адмиралу. Как показали раскопки, под адмиральским домом были погребены еще более древние развалины каменного строения, где жило когда-то семейство некоего Глинна, начавшего платить подати королю чуть ли не тысячу лет тому назад.

Митчел решил восстановить дом адмирала, а заодно и дом Глинна, заключенный в его недрах. Были приглашены архитектор и бригадир строителей, с которыми Митчел немедленно рассорился. Других в Бодмине достать было непросто, и хозяин решил сам взяться за постройку. Он нанял двух каменщиков.

– Чудесные простые люди, – рассказывал мне Митчел, – жаль только, что один из них совершенно неожиданно оказался беглым каторжником, осуждённым за убийство!

Когда полиция заинтересовалась одним из новых его коллег, Митчелу пришлось сколачивать другую артель. Эта задача была не без труда решена, и на, силоне холма у живописной речки Фой стали помаленьку вырисовываться очертания двухэтажного дома с дорическими колоннами вдоль фасада.

Здоровье Митчела пошло на поправку. Причиной тому была смена занятий, образа жизни и климата, а также, по-видимому, аскорбиновая кислота, которую он принимал в огромных количествах, следуя рецепту Л. Полинга (довольно редкий случай, когда один нобелевский лауреат по химии излечил другого, будущего нобелевского лауреата по химии).

Обосновавшись на новом месте и выздоровев, Митчел завел двух ослов – животных, которые, как он однажды мне признался, вызывают у него наибольшую симпатию. Других ослов в графстве Корнуэлл не было. По утрам Митчел запрягал одного из них в коляску и вез своих многочисленных детей в школу («Чтобы школа, – как говорил он, – не вызывала у детей слишком уж большой неприязни»). Затем отправлялся на ферму (в его руках она оказалась выгодным предприятием) или разъезжал по окрестностям в поисках развалившихся замков. Их восстановление стало новой страстью Митчела. Вплоть до недавнего времени один день в неделю он посвящал архитектурному надзору за возрождением какого-либо утраченного шедевра старинной архитектуры в Корнуэлле.

Глава 7. Поражения и победы

«Глинновские лаборатории»

Мир в Глинн Хаузе был взорван, когда однажды Митчел решил просмотреть пачку научных журналов за последние два-три года. С надеждой листал он страницы многочисленных статей по биоэнергетике. Что сталось с его гипотезой? Быть может, получены факты, ее подтвердившие? Или она опровергнута? Нет, хуже. Она не замечена.

Ах так! Митчел немедленно берется за организацию лаборатории, чтобы поставить опыты и проверить свою догадку. Он сразу же отказался от мысли вернуться в Эдинбург или любой другой город. Хватит с него тамошнего начальства и воздуха, отравленного автомобилями (еще один штрих к портрету: Митчел с одним из сыновей конструировал электромобиль). Лаборатория должна быть здесь, в Глинн Хаузе. Его собственная лаборатория – предприятие, независимое от всякой научной и ненаучной бюрократии.

А деньги? Что же, можно построить коттеджи и сдавать их дачникам. Кроме того, есть еще и доход от фермы! Но захочет ли кто-нибудь поехать в такую глушь, чтобы помочь ему в экспериментах? Посмотрим, не откликнется ли «старая гвардия», сотрудники его давно распавшейся группы в Эдинбурге.

Откликнулась Дж. Мойл. Пройдет несколько лет, и это имя прославится среди биоэнергетиков, но пока Мойл – безвестная и единственная соратница Митчела в его начинании. Нет слов, как благодарен он ей. И во вновь основанном научном предприятии под громким названием «Глинновские лаборатории для стимулирования фундаментальных биологических исследований» Митчел решает иметь двух директоров: это Мойл и он сам. Не беда, что директоров двое, а в их подчинении только один лаборант. Самоотверженность должна быть вознаграждена, и немедленно! Так Мойл стала директором.

Для лаборатории, размещенной в нескольких комнатах на первом этаже Глинн Хауза, Митчел закупил самое необходимое – центрифугу, полярограф, изотопов, реактивы. И начались опыты.

Первые опыты Митчела и Мойл

Митчел взялся за то, что было доступно при его более чем скромном оборудовании и, мягко говоря, не совсем укомплектованном штате.

Гипотеза предсказывала, что дыхание должно образовывать по одну сторону от мембраны кислоту, а по другую – щелочь. Так давайте в процессе дыхания мерить кислотность среды, благо для этого не требуется ничего, кроме рН-метра – простенького прибора, состоящего из пары электродов и вольтметра.

Первые опыты Митчела и Мойл

Из Печени белых крыс выделяли митохондрии, помещали их в бескислородные условия, а затем начинали реакцию окисления добавкой кислорода. Не изменится ли кислотность среды, в которой инкубируются митохондрии?

Первые опыты – первые неудачи. Но, может быть, рН-метр слишком груб, чтобы почувствовать небольшие сдвиги в концентрации Н+ ионов? Митчел становится стеклодувом и конструирует изящную ячейку совсем маленького объема и очень чувствительный электрод.

Вновь опыт с добавкой кислорода... Есть! Прибор регистрирует изменение рН. Среда закисляется, А что, если добавить вместо кислорода АТФ?

Снова закисление! Именно этого можно было ожидать, если бы АТФ расщеплялся той системой, которая в присутствии кислорода синтезирует АТФ.

Митчел и Мойл направляют в «Нэйчер» краткое сообщение, что их опыты подтверждают хемиосмотическую гипотезу.

«Варшавская битва». Поражение

Апрель 1966 года. Варшава. Европейский съезд биохимиков. Англичанин Б. Чэпел рассказывает о своих опытах с фосфолипидными мицеллами – полыми внутри сферическими частицами, стенки которых сделаны из жироподобных веществ, полученных из биомембран.

Oказывается, мицеллы отвечают на добавки веществ-разобщителей и антибиотика валиномицина точно такими же изменениями концентрации ионов калия и водорода, как митохондрии в опытах Митчел а и Мойл. Стало быть, разобщители и валиномицин атакуют липидный компонент системы, а не белки-ферменты: в мицеллах ферментов просто нет. Напомним, что сторонники «химических» схем сопряжения считали мишенью действия разобщителей именно ферменты. Казалось бы, новое подтверждение гипотезы Митчела? Oднако Чэпел пока уклоняется от такого вывода.

'Варшавская битва'. Поражение

После Съезда австралиец Э. Слейтер и польский биохимик Л. Войчак собирают семинар. Присутствует узкий круг специалистов по энергетике митохондрий. Среди них (впервые!) Митчел. Более того, ему оказана честь председательствовать на одном из заседаний.

Митчел использует вводное слово председателя, чтобы изложить хемиосмотйческую концепцию. В поддержку своей гипотезы он приводит полученное с Дж. Мойл данные опытов на рН-метре. Встает Б. Чане:

– А что будет, если в вашем, доктор опыте добавить вещество, связывающее ионы

– Я так полагаю, что ничего особенного не случится.

– Мы добавили такое вещество, и. все ваши изменения кислотности исчезли! Добавили кальция – и они возникли вновь. По-видимому, вы обнаружили какой-то побочный эффект» сопутствующий переносу кальция в митохондрии.

С Митчелом я впервые познакомился в Варшаве, Чанса знал уже пять лет, с Московского международного конгресса биохимиков. Двое спорящих являли собой разительный контраст: англичанин Митчел немного сутулый, с крупной головой и высоким лбом, редеющей шевелюрой чуть вьющихся седеющих волос, вспыльчивый и добродушный, как мистер Пикквик, и Чане? стройный, подтянутый американец с прямыми, гладко зачесанными назад волосами и жестким взглядом «морского волка» (в свои 54 года он стал чемпионом мира по парусным гонкам). Чане старше Митчел а на восемь лет, но он кажется моложе своего противника, динамичнее и гораздо приспособленней к спору.

Пытаясь опровергнуть Митчела, Чане применил свою «тяжелую артиллерию» физического эксперимента: прецизионный спектрофотометр для мутных сред, быструю регистрацию параметров в миллисекундной шкале времени и т. д. Митчел мог противопоставить этой новейшей американской технике лишь свой скромный самодельный рН-метр.

Вслед за Чансом Митчел а атакуют другие участники семинара.

А что же Чэпел? Он молчит...

Я прошу у Митчела слова. Но тот забыл о своих функциях председателя, смешался и потерял контроль над собранием. Вновь говорит Чане, Его слова как приговор несостоявшейся теории:

– Идея фантастична, результаты опытов неясны!

У меня сохранилась фотография: Митчел за кофе в перерыве между заседаниями, сразу после поражения. Рядом Чэпел. Митчел что-то доказывает своему собеседнику. Тот, отвернувшись, всем своим видом демонстрирует сомнение.

Серебряный звук трубы

Варшавский съезд стал одним из ключевых моментов в моей научной судьбе. После завершения работ по терморегулярному разобщению в мышцах (помните опыт со стрижеными голубями?) я понял: чтобы идти вперед, надо знать, как устроен загадочный механизм, сопрягающий дыхание с синтезом АТФ.

Вначале я отдал дань химической схеме. Но опыты, что мы вели с И. Севериной и Ю. Евтодиенко в одном из институтов на улице Вавилова, давали непредсказуемые результаты. Мы обнаружили кое-какие новые эффекты и даже открыли, сами того не желая, сильнейший дыхательный яд, но не приблизились к решению проблемы.

Я жил тогда у Калужской заставы. На моем пути к улице Вавилова был пустырь. Местами из-под песка пробивались зеленые ростки. Я загадал: если за лето пустырь покроется травой, мы на верной дороге. Вернувшись в конце августа из отпуска, я вновь увидел пустырь. По нему гулял ветер, закручивая песчаную пыль в маленькие смерчи. Земля осталась бесплодной.

К весне 1966 года стало ясно, что мы в тупике. В красной папке, где я обычно хранил программы будущих опытов моих сотрудников, впервые появился листок под девизом «План отступления». За мною тогда уже был отдел биоэнергетики в новой лаборатории, только что созданной в МГУ одним из отцов молекулярной биологии, академиком А. Белозерским.

Непросто было преодолеть инерцию. Идут опыты, публикуются статьи, делаются дипломные и аспирантские работы, и вдруг появляется шеф (шеф-то, кстати, без году неделя!) с сообщением, что прежний его план ни к черту, а двигаться нужно совсем в другую сторону...

Я все медлил, откладывал решающий разговор с ребятами в лаборатории и с таким вот настроением поехал в Варшаву. А здесь знакомство с Митчелом, баталия между ним и Чансом и, наконец, сокрушительное поражение Митчела.

Но не это, другое всплывает в памяти прежде всего, когда я вспоминаю Варшавский съезд. Полутемный конференц-зал, огромный экран, и на нем по темному фону белая кривая, неудержимо стремящаяся вниз. Опыт Б. Чэпела. Липидные мицеллы теряют калий, когда к ним добавили динитрофенол и валинамицин.

Выходит, мы три года искали то, что никто не терял! Не умный, всемогущий белок, а глупый липид, от которого только и требуется, что создать белку подходящие условия для его сложной работы, беспомощный, инертный жир – вот в действительности кто главное действующее лицо во всей этой драме под названием «разобщение».

Из Варшавы я отправился в Краков. Поезд пришел поздно вечером. Была темная, влажная весенняя ночь. По улицам прекрасного незнакомого города я отправился искать гостиницу. Вдруг где-то почти над моей головой в черном апрельском небе грянул тревожный серебряный звук трубы и оборвался на полуноте. Эти легендарный трубач с башни Марьяцкого собора возвещал о появлении врагов у городских стен и, сраженный вражеской стрелой, умолкал, не допев свою звонкую песню... С тех пор всякий pаs, когда я мысленно обращаюсь к весне 1966 года, из недр памяти возникает белая по черному фону кривая Чэпела и этот трубач на Марьяцком соборе.