Текст книги "Рассказы о биоэнергетике"

Автор книги: Владимир Скулачев

сообщить о нарушении

Текущая страница: 10 (всего у книги 14 страниц)

И вот теперь неожиданно оказалось, что работа по фосфолипидам – лишь небольшой и явно второстепенный аспект обширной бактериородопсиновой программы Кораны, в которой изучение белка занимает подобающее ему центральное место. Исследование структуры бактериородопсина Корана вел в полной тайне, без каких-либо устных или тем более печатных сообщений о промежуточных этапах расшифровки полипептида. Уверовав в свою счастливую звезду, он рассчитывал, по-видимому, «выиграть гонку у русских», которые в его предшествующей эпопее с синтезом гена не числились среди серьезных конкурентов.

Но на этот раз великий индус ошибся в своей тактике и проиграл. Вероятно, публикация частичной структуры бактериородопсина была жестом отчаяния, вызванным сообщением, что полная структура этого интереснейшего белка уже опубликована в советском журнале. Может быть также, здесь не обошлось без мысли о том, что статья на русском языке останется не замеченной западной публикой. Но и этот расчет не оправдался. Имя Овчинникова слишком хорошо известно за рубежом, чтобы подписанная им статья не привлекла внимания специалистов. Кроме того, уже весной 1979 года Ю. Овчинников, Н. Абдулаев, А. Киселев, М. Фейгина, Н. Лобанов и И. Назимов опубликовали полную аминокислотную последовательность бактериородопсина по-английски а ФЕБС Леттерз.

Корана все же завершил начатую работу и напечатал свою структуру спустя примерно год после статьи советских авторов в «Биоорганической химии». Данные двух лабораторий практически совпадали на протяжении всей 248-членной цепи. Лишь в нескольких местах обнаружились единичные различия, связанные, по-видимому, с тем, что советские и американские биохимики работали с различными разновидностями бактерий.

Так закончился важнейший этап структурного исследования бактериородопсина: была расшифрована последовательность аминокислот в его полипептидной цепи.

Но какова укладка этой цепи в мембране? На этот вопрос мог бы дать ответ рентгеноструктурный анализ кристаллов бактериородопсина. Однако получение кристаллов мембранного белка, совершенно нерастворимого в воде, – это пока что нерешенная задача. (Лишь в самое последнее время Д. Остерхельт сообщил о кристаллизации бактериородопсина, но еще не ясно, будут ли такие кристаллы пригодны для анализа.)

Правда, в мембране бактериородопсин существует в кристаллическом состоянии. Но это двумерный плоский кристалл. Толщина образца (около 50 ангстрем) здесь слишком мала, чтобы стало возможным применение классического рентгеноструктурного анализа. И тем не менее именно изучение природных двумерных кристаллов бактериородопсина позволило получить сведения о его пространственной структуре.

Р. Хендерсон в Кембридже, комбинируя электронную микроскопию с математическим анализом, определил трехмерную структуру бактериородопсина в фиолетовых бляшках – фрагментах бактериальной мембраны, содержащих этот белок. Выяснилось, что полипептидная цепь бактериородопсина семь раз пересекает мембрану. Она образует семь спиральных участков, причем длина каждого из них равна толщине мембраны. Каждый из таких участков формирует колонну, укрепленную перпендикулярно плоскости мембраны и пронизывающую всю ее толщу.

Хендерсон описал структуру бактериородопсина с точностью до 7 ангстрем. Этого недостаточно, чтобы определить пространственные координаты отдельных атомов. Однако общий контур молекулы и расположение отдельных ее частей уже могли быть описаны вполне надежно, И вновь, как и при расшифровке аминокислотной последовательности, бактериородопсин оказался первым мембранным белком, трехмерная структура которого была в общих чертах выяснена.

Сопоставив данные по трехмерной структуре и последовательности аминокислот, Овчинников предложил модель бактериородопсина, где полипептидная цепь образует семь спиральных колонн, причем можно определить примерное расположение каждой из 248 аминокислот этой цепи в пространстве. Такой анализ позволил, в частности, локализовать остаток ретиналя – окрашенную группировку, поглощающую свет. Выяснилось, что ретиналь прикреплен к аминогруппе лизина – аминокислоты, расположенной на 216-м месте, считая от одного из концов полипептидной цепи. 216-й лизин находится в глубине мембраны, точнее, в седьмой спиральной колонне на расстоянии примерно 1/5 пути от наружной поверхности мембраны к ее внутренней стороне.

Таковы сведения о строении молекулы бактериородопсина. Как видно, уровень наших знаний хотя и не достиг здесь еще атомного разрешения, но уже достаточен для того, чтобы приступить к созданию «рабочего чертежа» этого генератора тока.

Как же он работает?

Чтобы точно ответить на такой вопрос, нужно было бы проследить путь протона, переносимого бактериородопсином через мембрану за счет энергии поглощенного кванта света. Что известно по этому поводу?

Свет, поглощенный ретиналем бактериородопсина, вызывает изомеризацию ретиналя: в молекуле ретиналя появляется излом, которого до этого не было. Изомеризация сопровождается отщеплением протона от альдиминной группы в месте прикрепления ретиналя к белку. Затем самопроизвольно, без участия света происходит обратная изомеризация ретиналя и присоединение протона к альдимину.

«Минимальная» гипотеза о механизме работы бактериородопсина исходит из того, что протон, который отщепился под действием света от альдимина, переносится к наружной поверхности мембраны бактерии и выделяется во внешнюю среду. А вот протон, присоединяющийся к альдимину после обратной изомеризации ретиналя, поступает уже с противоположной стороны мембраны, то есть из воды, заключенной внутри бактериальной клетки. В результате оказывается, что один квант света вызывает перенос одного протона из бактерии во внешнюю среду.

Такова гипотеза, но как ее проверить? Ведь речь идет о переносе одного-единственного протона внутри сложной белковой молекулы, масса которой почти в 30 тысяч раз больше массы протона!

К счастью, оказалось, что отщепление протона от альдимина сопровождается обесцвечиванием бактериородопсина. По обесцвечиванию можно судить о том, когда начался процесс транспорта протона и сколько времени протон «находится в пути». Измерения с помощью быстродействующего спектрофотометра показали, что протон стартует через несколько микросекунд после поглощения бактериородопсином светового кванта, а общее время в пути – около десяти миллисекунд.

Час от часу не легче! Сначала мы обнаружили, что нам надо уследить за частицей в 30 тысяч раз более мелкой, чем ее носитель, а теперь выясняется, что время перемещения этой частицы измеряется тысячными или даже миллионными долями секунды. За это время протон проходит путь, равный 50 ангстремам, или 0;000000005 метра.

Невелика дистанция!..

А ведь нужно засечь местонахождение протона на промежуточных этапах его перемещения в белковой молекуле, если мы хотим начертить его траекторию и понять, почему он движется так, а не иначе. Значит, интересующие нас отрезки времени и расстояния в действительности еще меньше.

В решении этой на первый взгляд неподъемной проблемы помог метод, который уже однажды выручил нас, когда мы пытались наладить прямое измерение генерации электрического тока и напряжения мембранными белками.

Помните, как удалось зарегистрировать образование разности потенциалов бактериородопсином? Протеолипосомы, содержащие в свой мембране бактериородопсин, прикрепили к плоской искусственной мембране, по обе стороны которой были электроды. Освещение вызывало транспорт ионов Н+ через мембрану протеолипосом, что регистрировалось подключенным к электродам вольтметром как уменьшение количества положительных зарядов в том отсеке, куда обращена покрытая протеолипосомами сторона плоской мембраны.

Современная электрометрическая техника достигла таких вершин, что уже можно измерять генерацию разности потенциалов со скоростью 10-7—10-8 секунды. Это гораздо быстрее, чем время, затрачиваемое молекулой бактериородопсина на перенос одного протона через мембрану. Стало быть, само по себе измерение перемещений протона в мембране не встречает принципиальных трудностей. Но как это сделать практически?

Протеолипосомы, покрывающие поверхность плоской мембраны на отверстии радиусом около 1 миллиметра, содержат в общей сложности порядка миллиона молекул бактериородопсина. Проблема состоит в том, чтобы синхронизировать работу всех этих фотогенераторов, каждый из которых работает сам по себе. Оказалось, что в принципе и это можно сделать. Существуют лазеры, генерирующие световую вспышку продолжительностью менее 10-7 секунды. Если осветить молекулы бактериородопсина такой вспышкой, то все они сработают практически одновременно и только один раз.

Итак, предельно быстрые скорости измерения разности потенциалов и предельно короткие вспышки света – вот что необходимо, если мы собираемся следить за судьбой протона, переносимого бактериородопсином. К этому надо добавить предельно высокую чувствительность измерительной аппаратуры, чтобы уловить изменение электрических параметров бактериородопсина при небольших смещениях протона внутри его молекулы.

Работать на пределе технических возможностей можно лишь при условии, что исследуемый объект сам по себе стабилен и выдает некий повторяющийся от опыта к опыту результат.

Казалось бы, бактериородопсин должен лучше, чем что бы то ни было, подходить для такой работы (вспомним чрезвычайную устойчивость этого белка к всевозможным изменениям условий среды). Спору нет, сам по себе бактериородопсин стабилен, да вот плоская мембрана, на которую нужно сорбировать протеолипосомы с этим белком, не слишком прочна. К тому же ее прочность уменьшается после присоединения протеолипосом. Как выйти из этого нового затруднения?

Чтобы ответить на поставленный вопрос, придется подумать о причине нестойкости плоской искусственной мембраны, сделанной из фосфолипидов. Причина эта кроется, по-видимому, в огромной диспропорции между толщиной и протяженностью мембраны. По существу, жидкокристаллическая мембрана, имеющая в поперечнике около 5•10-9 метра, закрывает отверстие диаметром около 2•10-3 метра. В привычных для повседневной жизни масштабах это все равно что пленкой толщиной 2,5 миллиметра перекрыть морской пролив глубиной и шириной в 1 километр.

Столь тонкие искусственные мембраны – излюбленный объект исследований по моделированию свойств природных мембран, имеющих ту же толщину. Однако так ли необходимо работать с тонкой мембраной в нашем случае? Ведь у нас она просто сорбент для протеолипосом. Если уж мы решили следить за движением протона в молекуле бактериородопсина, то в общем-то безразлично, на чем сидит бактериородопсиновая протеолипосома – на тонкой мембране или какой-то другой подложке.

И мы отказались от тонких («черных») мембран, использованных в первых наших опытах с протеолипосомами. Вместо них взяли коллодиевую пленку, пропитанную раствором фосфолипидов в углеводороде декане. Это позволило не только стабилизировать систему, но и увеличить в 10 раз диаметр отверстия между двумя отсеками, куда помещены электроды.

В результате количество бактериородопсиновых протеолипосом, сорбированных на поверхности фильтра, было в 100 раз больше, чем в случае тонкой мембраны. Фотоэлектрический эффект системы, пропорциональный содержанию бактериородопсина, также должен был увеличиться на два порядка. Если бы даже в этом случае эффект оказался все еще слишком мал, чтобы быть зарегистрированным вольтметром, то есть меньше уровня шумов измерительной аппаратуры, мы могли бы вытянуть его из-под этих шумов, многократно повторяя вспышку лазера и используя ЭВМ для отделения эффекта от шумов.

Подключив ЭВМ, мы завершили наконец сооружение установки, с помощью которой можно было бы, в принципе говоря, приступить к изучению белка – генератора тока. По мере монтажа установки небольшая пластмассовая ячейка, разделенная на два отсека перегородкой с отверстием посередине (та, что служила нам верой и правдой в первых опытах с бактериородопсином), обросла таким количеством сложнейших устройств, что нужен был Л. Драчев в качестве специального гида, чтобы объяснить, где же у этого агрегата начало, а где конец.

Неодимовый лазер, система зеркал, ячейка с коллодиевой пленкой и протеолипосомами, каскад быстродействующих усилителей электрических сигналов, блок памяти, ЭВМ и особая система, синхронизирующая работу оптической и электрической систем с точностью до сотых долей микросекунды. Как разительно отличается эта установка от аппаратуры первых опытов биоэнергетиков, где, кроме манометра и примитивного колориметра, никаких других приборов не требовалось! Отсчет времени тогда шел в минутах, а за процессом следили по убыли кислорода и фосфата, если измерялось окислительное фосфорилирование в митохондриях. О пространственном векторе процесса вообще не было и речи. Точность измерения зависела от того, насколько вам удалось совместить уровень ваших глаз с уровнем жидкости в манометре.

Теперь вместо сложно устроенных митохондрий наш объект – индивидуальный, белок, временная шкала – доли микросекунды, а задача – проследить за передвижением протона, путешествующего от одной поверхности мембраны к другой по встроенной в эту мембрану белковой молекуле.

Но как сработает вся эта громада аппаратуры? Хватит ли чувствительности вольтметра? Не затрубит ли какая-нибудь паразитная емкость шкалу времени?

Драчев уверен, что все будет в порядке. Его гарантия – залог успеха. Говорят, что у Драчева есть необычайное свойство: в его присутствии любой прибор работает нормально.

И вот наконец долгожданный опыт. Еще вчера А. Каулен приготовил протеолипосомы из бактериородопсина и соевого фосфолипида. Другим фосфолипидом пропитана коллодиевая пленка, закрепленная в отверстии между отсеками с электродами. В один из отсеков три часа назад добавили протеолипосомы. За это время они должны были прилепиться к поверхности пленки.

Проверяем аппаратуру. Луч осциллографа пробегает наискосок зеленый экран, оставляя за собой светлый немеркнущий след. Это разряжается «темновая» разность потенциалов между электродами, только что опущенными в измерительную ячейку.

Еще несколько минут ожидания. «Темновая» разность потенциалов исчезла – осциллограф чертит одну за другой горизонтальные прямые, ложащиеся след в след. Это нулевая линия.

Ну что ж, попробуем для начала повторить наш старый добрый опыт по генерации фотопотенциала при постоянном освещении. Л. Драчев опускает тумблер, чтобы остановить бесконечный бег нулевой.

Нажата кнопка, и отверстие, ведущее к ячейке, освещается постоянным светом мощной лампы. Перевожу взгляд на экран. Здесь записан мощный фотоэффект: между электродами возникла разность потенциалов порядка 200 милливольт. Выключаем свет: кривая отклоняется вниз, неудержимо стремясь к нулевому уровню.

Порядок. Теперь черед за лазером. Какую выбрать измерительную шкалу? Конечно, почувствительней. Ведь бактериородопсин сработает всего один-единственный раз.

Вспышка. На какое-то мгновение (мы знаем, на какое – 3bull;10-8 секунды!) ячейка высвечивается яркой зеленой молнией. Луч осциллографа взметнулся вверх, зашкалил и вернулся назад, к нулю. Есть ответ, да какой – не хватило шкалы!

Ученые в работе

Взяли в 10 раз более грубую шкалу, снова вспышка, снова зашкал. Еще в 10 раз загрубили шкалу, и опять недостаточно. Лишь с четвертого раза удалось наконец записать фотоэффект. Он оказался около 60 милливольт.

Да, с таким эффектом работать можно! Но стоило ли городить всю эту махину? Пока что из всех новшеств потребовался один только лазер.

Эффект хорош, что и говорить! Такого еще не видел никто: генерация потенциала при однократном срабатывании бактериородопсина! Но ведь это не цель, а лишь необходимое условие, чтобы двигаться дальше. Нам надо знать, как переносится протон.

Внимательно рассматриваем кривую нарастания фотопотенциала после вспышки лазера. Нет, эта техника все же чудо! Потенциал нарастал в течение каких-то десяти миллисекунд. Блок памяти запомнил кривую и выдал на осциллограф, который записал ее за две секунды. Мы замедлили время в 200 раз. А потом и вовсе остановили его. Теперь кривая на экране будет светиться до тех пор, пока в этом есть необходимость. Да, кривая красива: на первый взгляд настоящая экспонента. Только в самом начале какая-то излишняя крутизна. Вводим кривую в ЭВМ. Программист А. Драчев просит вычислительную машину измерить временную шкалу в самом начале кривой. Теперь это будут не милли-, а микросекунды...

Занятна сама процедура общения с этой машиной. Нажав тумблер, мы вводим кривую в память машины. Затем программист печатает на клавишах вроде бы обычной пишущей машинки свою просьбу к ЭВМ. Печатает не какой-нибудь код, а прямо-таки наши обычные, человеческие слова. Этот текст немедленно воспроизводится на экране.

Вскоре на том же экране появляются слова, программистом не напечатанные. Это уже речь самой машины. Она сообщает, что приняла информацию.

Несколько секунд, и на другом экране возникает наша кривая, но теперь уже начало ее дано в микросекундной шкале.

Машина спрашивает, довольны ли мы ее работой. Мы в восхищении, но А. Драчев считает, что великоваты шумы, и просит машину усреднить данные. Еще несколько секунд, и появляется новый вариант нашей кривой – краше прежнего!

А ведь не зря А. Драчев убрал шумы! Теперь видно, что в действительности кривая генерации фотопотенциала состоит из трех фаз. Первая невелика по амплитуде и направлена противоположно основным фазам II и III. Она завершается быстрее, чем может измерить даже наша сверхбыстрая техника (время ее возникновения меньше 10-7 секунды). Фаза II заканчивается к сотой микросекунде, а фаза III – к двадцатой миллисекунде после вспышки.

Получив этот результат, мы решили заменить воду в ячейке на D2O, тяжелую воду, в расчете на то, что это замедлит фазы генерации фотопотенциала, которые связаны с переносом Н+ (известно, что все процессы, где участвует ион водорода, замедляются, если вместо него в среде присутствует ион дейтерия, D+).

Вспышка лазера, и на экране дисплея ЭВМ яркий зеленый лучик выписывает динамику фотоэффекта в D2O. Фазы II и III явно затянуты. А. Драчев приказывает машине рассчитать время, за которое фаза II достигает 50 процентов своей величины. Это время заметно больше в D2O, чем в Н2О. То же для фазы III.

Для наглядности программист вызывает из недр памяти ЭВМ кривую прошлого опыта (с обычной водой). На это уходит всего несколько секунд. Лучик рисует другую кривую, она ложится гораздо левее той, которая была только что получена в опыте с D2O.

А что с фазой I? К сожалению, ее скорость в D2O все еще слишком велика и потому ускользает от измерения.

Из опыта с D2O можно было заключить, что по крайней мере фазы II и III как-то связаны с переносом Н+.

Независимое подтверждение этого вывода было получено, когда мы сопоставили наши кривые с динамикой спектральных превращений бактериородопсина.

Как показали в свое время У. Стокениус и Д. Остерхельт, поглощение кванта света бактериородопсином ведет к весьма характерному изменению его окраски: сначала спектральный максимум бактериородопсина несколько смещается в красную область, затем происходит резкий сдвиг в противоположную (синюю) область, после чего максимум возвращается в исходное положение.

Так вот времена этих трех спектральных сдвигов оказались весьма сходными с тремя фазами обнаруженного нами фотоэлектрического эффекта: красный сдвиг неизмеримо быстр, синий – десятки микросекунд, возврат к исходному положению – десятки миллисекунд. Мы повторили спектральные измерения Стокениуса и Остерхельта в условиях нашего эксперимента и убедились в хорошей корреляции спектрального и электрического ответов.

Из работ А. Льюса было известно, что синий сдвиг в окраске бактериородопсина обусловлен отщеплением протона от атома азота в альдиминной группе бактериородопсина, а последующий обратный сдвиг – протонированием того же атома.

Теперь сопоставим основные факты, чтобы попытаться представить себе механизм генерации протонного потенциала бактериородопсином. Факты таковы:

1) бактериородопсин переносит протон через мембрану бактерии в направлении изнутри (из цитоплазмы бактериальной клетки) наружу, в омывающий бактерию раствор. Этот процесс сопряжен с поглощением кванта света;

2) свет вызывает изомеризацию ретиналевого остатка, прикрепленного к белковой части бактериородопсина через альдимин, который протонирован в темноте и депротонирован на свету;

3) процесс генерации потенциала при транспорте

протона складывается из трех стадий (фаз), сильно различающихся по своим скоростям;

4) каждой из этих фаз соответствует определенный спектральный переход, причем фаза II коррелирует с депротонированием альдимина, в то время как фаза III – с последующим присоединением к нему протона.

Приняв во внимание все эти наблюдения, можно сформулировать следующую «минимальную» гипотезу.

Свет вызывает такое изменение в окружении протонированного альдимина, что его сродство к протону уменьшается, он отщепляется и затем выделяется в окружающий раствор. После этого окружение альдимина «нормализуется», он переходит в «темновое» положение и вновь приобретает способность связывать протон. Однако теперь уже протон может быть взят только из цитоплазмы бактериальной клетки, но не из внешнего раствора.

Почему же протон, сидящий в темноте на азоте альдимина, выделяется во внешнюю среду, а поглощается из цитоплазмы клетки?

Вероятно, в молекуле бактериородопсина есть два пути, проводящих протоны: один (выходной путь) из глубины мембраны в наружную среду, другой (входной) – из цитоплазмы в глубь мембраны.

В темноте протонированный альдимин находится в конце входного пути. Поглощение светового кванта вызывает изомеризацию ретиналя: остаток ретиналя как бы изламывается, так что прикрепленный к нему на конце атом азота альдимина выходит из контакта с входным путем и перемещается в некое новое положение. Оно в начале выходного пути. Здесь происходит депротонирование альдимина, и выделившийся ион Н+ перемещается наружу.

На следующем этапе происходит обратная изомеризация ретиналя, и альдимин вновь оказывается в конце входного пути, но уже в своей депротонированной форме. Из цитоплазмы по входному пути подтягивается ион Н+ и протонирует альдимин. Цикл завершается.

В рамках этой схемы фаза I фотоэлектрического эффекта есть не что иное, как перемещение протонированного альдимина при изомеризации ретиналя под действием света. Фаза II – перенос протона от альдимина наружу по выходному пути. Фаза III – перенос протона из цитоплазмы к альдимину.

Что требуется для проверки такой гипотезы?

Точное знание, во-первых, местоположения альдимина в темноте и на свету и, во-вторых, устройства входного и выходного путей. Задача это, конечно, сложнейшая, но не безнадежная. Можно даже сказать, что с расшифровкой аминокислотной последовательности и пространственной структуры бактериородопсина наметилась реальная перспектива ее решения. Лишь взяв этот барьер, мы сможем наконец составить чертеж простейшего биологического генератора – бактериородопсина.