Текст книги "Кризис аграрной цивилизации и генетически модифицированные организмы"

Автор книги: Валерий Глазко

сообщить о нарушении

Текущая страница: 6 (всего у книги 19 страниц)

Методология прикладного использования ДНК-технологий

ДНК-технология или генная (генетическая) инженерия – направление исследований в генетике, в рамках которого разрабатывают приемы, позволяющие по заранее намеченному плану перестраивать геном организмов (совокупность генетических элементов организма), изменяя в нем генетическую информацию. С помощью рестриктаз и лигаз получают перестроенные (химерные) молекулы ДНК. Их еще называют рекомбинантными – полученными в результате объединения in vitro в природе никогда вместе не существующих фрагментов ДНК (например, ДНК бактерии и растения). Живую систему для размножения рекомбинантных молекул выбирают среди бактерий. Получение рекомбинантных ДНК в количестве, необходимом для проведения генетической модификации, позволяет перейти непосредственно к ключевому этапу получения ГМ культур: трансформации растительных клеток. В идеале трансформационная система должна отвечать определенным условиям: быть простой, эффективной и дешевой. Однако, несмотря на сравнительно широкий выбор методических приемов, всем требованиям не соответствует ни один из них. Тем не менее в настоящее время для производства трансгенных культур в промышленных масштабах в основном применяются два способа модификации растительного генома – агробактериальный (то, как это делается в природе, см. выше) и баллистический, баллистическая трансформация растительных клеток (еще называемый микробомбардировкой, методом ускорения частиц, биолистикой – термин, произошедший от объединения слов «биология» и «баллистика») состоит в «обстреле» растительных клеток золотыми или вольфрамовыми частицами, которые играют роль переносчика рекомбинантной ДНК. В сущности, микрочастицы могут быть из любого химически инертного металла с достаточно высокой молекулярной массой (золото, вольфрам, палладий, родий, платина, индий), чтобы не образовывать с ДНК металлорганических комплексов и обладать достаточно высокой кинетической энергией для эффективной пенетрации клеточной стенки. Частицам размером 1,5-3 микрона, конъюгированным с ДНК, придается скорость 300-600 м/сек посредством электрического разряда или декомпрессии в направлении клеток-мишеней, подлежащих трансформации. Несмотря на то, что эффективность этого способа невысока (не более 15%), баллистический метод – весьма распространенный прием трансформации однодольных растений.

В последнее время разработан и успешно применен комбинированный метод трансформации, названный агролистическим. Он основан на объединении баллистического и агробактериального способов и заключается во введении в геном растения каким-либо физическим методом (в большинстве случаев баллистическим) чужеродной ДНК, включающей агробактериальные гены.

Конечный этап – получение трансгенных растений, как правило, преодолевается легче, чем предыдущие процедуры. Благодаря тому, что многие клетки растений тотипотентны, то есть из любой единичной клетки может вырасти целое плодоносящее растение, трансгенные растения получают из трансформированных клеток.

Культивирование растений с модифицированным геномом включает несколько серий пересевов на селективных средах. Длительность регенерации трансформированных растений достигает нескольких месяцев, причем все это время они находятся в среде с высокими концентрациями селективных веществ. Как правило, применяются маркерные гены двух основных типов – селективные и репортерные. Селективные придают растениям устойчивость к антибиотикам или гербицидам, позволяя трансформированным растениям расти в условиях действия селективных агентов. Репортерные гены детерминируют синтез нейтральных для клеток белков, наличие которых в тканях может быть легко установлено. При получении генетически модифицированного растения, устойчивого к пестицидам, ген устойчивости выступает как в роли целевого, так и селективного гена.

Присутствие маркерных генов, особенно устойчивых к антибиотикам, служит одним из главных доводов против использования трансгенных продуктов. Потому-то и был разработан и теперь активно применяется ряд методических подходов, обеспечивающих элиминацию маркерного гена, когда фактически он уже не нужен.

После получения целого трансгенного растения проводится анализ геномной ДНК растений, направленный на то, чтобы определить присутствие  целевого  гена.  Он  проводится  различными  путями. В большинстве случаев это достаточно сложные и дорогостоящие лабораторные методы, например, ПЦР-анализ, рестрикционный анализ и др. Заключительная стадия лабораторного тестирования ГМ растений включает биологические исследования, направленные на подтверждение стабильного фенотипического проявления целевого признака.

С использованием описанных выше подходов к настоящему времени в мире созданы и доведены до испытаний в полевых условиях ГМ формы сельскохозяйственных растений, относящиеся более чем к 50 видам. Так, получены трансгенные формы томатов (более 260), сои (более 200), хлопчатника (более 150), тыквенных растений (более 80), табака (более 80), а также пшеницы, риса, подсолнечника, огурцов, салата, яблонь и других (более 70). Из них значительную часть представляют растения, устойчивые к насекомым-вредителям и гербицидам.

Большинство производящихся в настоящее время в промышленных объемах ГМ сельскохозяйственных растений (или растений первого поколения) имеют свойства, обеспечивающие повышение урожайности или облегчение уборки, хранения, переработки урожая. Эти качества позволяют снизить применение гербицидов и инсектицидов, что оказывает положительное влияние на окружающую среду, сократить количество технологических операций при переработке, а также уменьшить потери урожая, повысить качество продукции, сэкономить средства и материальные ресурсы.

Прикладные ДНК-технологии: достижения и перспективы

Основные задачи современной селекции

Рассматривая возможности современной селекции и генетической инженерии, Жученко (2003) определяет принципиально новые приоритеты самой селекции растений, вытекающие из их современного понимания:

• роли интегрированности генома у высших эукариот, проявляющейся в формировании блоков коадаптированных генов и сохранении их status quo при передаче наследственной информации от одного поколения другому;

• необходимости перехода от управления изменчивостью моногенных признаков к комбинаторике количественных (полигенных) признаков, многие из которых относятся к хозяйственно ценным;

• первостепенной роли мейотической рекомбинации (а не мутаций) в формировании потенциальной, свободной и доступной отбору генетической изменчивости у цветковых растений;

• роли абиотических и биотических факторов внешней среды, определяющих не только направление и темпы естественного отбора («формирующее») влияние биоценотической среды), но и выступающих в качестве индукторов генетической изменчивости (мутационной, рекомбинационной, репарационной, транспозиционной);

• необходимости сочетания в сортах и гибридах высокой потенциальной продуктивности, устойчивости к действию абиотических и биотических стрессоров, а также продукционных и средообразующих (почвоулучшающих, фитомелиоративных, фитосанитарных, ресурсовосстанавливающих, эстетических и др.) функций;

• важности развития новых направлений селекции, включая фито– и биоценотическое, биоэнергетическое, экотипическое, экологическое, симбиотическое, а также апомиктическое, гаметное (гаплоидия позволяет фиксировать последствия мейотической рекомбинации, а апомиксис, связанный с полиплоидией, используется для уменьшения зависимости продуктивности растений от неблагоприятных условий внешней среды.) и др.;

• возможности использования «доместикационного синдрома» с целью введения в культуру новых видов и экотипов растений (экологическая и экотипическая селекция).

Человечеству требуется все больше продуктов питания и промышленного сырья, получаемого из растений. Поэтому усовершенствование растений, предназначенных для использования в сельскохозяйственном производстве, сейчас является наиболее интенсивно развивающейся областью применения ДНК-технологий. Традиционная селекция имеет существенное ограничение. Ее приемы позволяют получать гибриды только родственных растений. Скрещивать картофель разных сортов можно, но растения разных видов (за редчайшими исключениями) нельзя, например нельзя получить гибрид сливы и яблони. Ветви древа жизни, пройдя долгий эволюционный путь, разошлись друг от друга очень далеко. Их развитие долго шло независимо. Потому-то разные виды не «переплетаются» меж собой. И нельзя скрестить кошку с собакой, человека с обезьяной. И хотя есть мул, гибрид осла и лошади, он бесплоден, так же как и гибрид льва с тигрицей.

Природа воздвигла между далекими видами непреодолимый барьер, который мешает селекционной работе. Фактически селекционеры тасуют одни и те же гены. Селекционерам удалось получить гибрид капусты и редьки, но, к их глубочайшему разочарованию он имел корни капусты, а ботву – редьки! А вот ДНК-технологи – генные инженеры – почти с первой попытки смогли сотворить гибрид свеклы со шпинатом и, если потребуется, смогут вырастить все что угодно и на заказ.

В США и Канаде гибридами ГМ рапса заняты большие площади. Такие сорта важны и для Восточной Европы, где использование рапсового масла могло бы оказаться очень перспективным. Добавление всего 1% этого масла к дизельному топливу значительно уменьшает загрязнение окружающей среды соединениями серы, которых особенно много в выхлопах дизельных двигателей. Кроме того, это яркий пример по сути безотходного (индустриального) сельского хозяйства – рапсовое масло используют в промышленности, а жмых идет на корм скоту.

Появилась возможность создавать съедобные сорняки. Биоинженерия меняет не только растения, но и наши представления о них. Возможно, что завтра, вместо того чтобы ломать голову, как избавиться от сорняков, мы будем их есть.

ГМ растения, устойчивые к насекомым-вредителям

В процессе получения ГМО с помощью трансгеноза первостепенное внимание должно быть уделено повышению устойчивости сортов и гибридов к болезням, вредителям и сорнякам. О важности этого направления селекции свидетельствует уже тот факт, что общее число потенциально вредоносных для агроэкосистем видов достигает 80-100 тыс., в том числе свыше 30 тыс. возбудителей грибных, бактериальных и вирусных заболеваний, около 10 тыс. членистоногих и др. Несмотря на увеличение количества применяемых в сельском хозяйстве пестицидов (например, в США – 400 тыс. т в год), к началу XXI столетия потери урожая составляют в среднем 33%. Общая же цена потерь урожая сельскохозяйственных растений в мире, согласно имеющимся оценкам, только от болезней достигает 50 триллионов долларов в год.

Одним из факторов риска в получении высоких и стабильных урожаев является поражение посевов насекомыми. Так, например, ущерб от поражения посевов кукурузы кукурузным мотыльком (Ostrinia nubialis) в США составляет около миллиарда долларов в год. А тысячи тонн инсектицидов, расходуемых ежегодно, естественно, не очень полезны окружающей среде.

Молекулярные биологи сумели обеспечить организмы иммунитетом к их вредителям. Наиболее распространенным приемом создания инсектицидных растении сейчас является введение в их геном гена Сгу– белка (Bt-токсина), естественного инсектицида, вырабатываемого почвенными бактериями Bacillus thuringiensis. Bt-защищенные растения экспрессируют один или несколько Cry-белков для защиты от чешуекрылых и жесткокрылых вредителей.

Почвенная грамположительная бактерия B.thuringiensis продуцирует в процессе спорообразования кристаллические белковые включения. Эти включения состоят из белков, называемых Сгу-белками. Они обладают селективным действием против узких групп насекомых, причем различные классы белков эффективны для применения против разных насекомых-вредителей. Сгу-белки присоединяются к специфическим участкам клеток пищеварительной системы насекомых и образуют ионоселективные каналы в клеточных мембранах. Это приводит к чрезмерному поступлению воды, клетки разбухают, что приводит к их лизису и последующей гибели насекомого.

Важно иметь в виду, что данный белок термонестабилен, т.е. разрушается при термической обработке продукции. Кроме того, он нетоксичен для позвоночных животных. Препараты из бета-эндотоксина используются уже около полувека в качестве инсектицидов для опрыскивания.

В мире известны тысячи штаммов B.thuringiensis с разнообразными генами и широким потенциалом биологически активных белков. В целом эти штаммы представляют богатейший источник структурных компонентов многочисленных будущих препаратов для борьбы с самыми разнообразными вредителями.

Успехи генной инженерии неизмеримо расширили спектр биологических объектов перспективных в качестве доноров генов. Помимо растений, ими могут быть насекомые, грибы, бактерии, вирусы. Отсюда стремление биотехнологических компаний создавать свои частные банки генов. Так, фирма «Бристайл-Майерс» (США) имеет патенты на многие бактериальные культуры, в числе которых образцы из Индии, а также из Филиппин, Фиджи, Бразилии, Перу и др. По нормам промышленного патентования фирма приобретает монопольное право на их использование.

В настоящее время компаниями «Monsanto», «AgrEvo», «Мусоgеn» и «Novartis» созданы другие трансгенные формы, устойчивые к насекомым, так называемые Bt-растения – соя, хлопчатник, кукуруза.

Специалисты полагают, что применение Bt-растений может иметь не только хорошее коммерческое будущее, но и экологический эффект. Известно, что только 5% внесенного инсектицида срабатывает по назначению, остальные 95% попадают в окружающую среду, уничтожая многие виды насекомых, в том числе и полезных. Сокращение же объемов применения инсектицидов приведет к восстановлению популяций многих полезных насекомых, что, несомненно, положительно скажется на многих видах растительного и животного мира.

По данным Kcy, в Китае получены трансгенные растения более 50 видов, которые включают основные злаки (рис, пшеница, кукуруза, сорго), а также хлопчатник, сою, рапс, арахис, овощные культуры (кочанная капуста, цветная капуста, перец), плодовые (яблоня, цитрусовые, киви), древесные (тополь, эвкалипт, шелковица). Более 100 генов, включая маркерные, использовано в этих экспериментах. Трансгенный табак, устойчивый к вирусам, выращивали уже в 1994 г. на площади 36 000 га. Прошли полевые испытания трансгенные растения хлопчатника с генами Bt или ингибитора протеаз, устойчивые к насекомым, служащие исходным материалом для создания устойчивых к насекомым сортов этой культуры для различных районов Китая. Разработанный для хлопчатника в 1983 г. Жоу (Zhou) метод трансформации по следу пыльцевой трубки с успехом использовался для генетической трансформации риса, пшеницы, сои. Наиболее значительным успехом в Китае считается получение пшеницы, устойчивой к вирусам за счет гена белка оболочки, и устойчивого к насекомым хлопчатника с геном эндотоксина Bt.

Белок Bt активен не только против европейского мотылька кукурузы, но также против юго-западного мотылька и кукурузной моли. Ориентировочные потери от этих основных вредителей кукурузы составляют 800-900 млн долл. ежегодно.

Гербицидустойчивые растения

Современное сельскохозяйственное производство невозможно без применения гербицидов. Применяемые ранее гербициды, как селективные, так и тотального действия, считались сравнительно дорогими и оказывали отрицательное воздействие на окружающую среду, накапливаясь в почве, почвенных водах и произрастающих растениях. Синтезированы гербициды нового поколения, которые значительно более эффективны и поэтому применяются в очень низких концентрациях и быстро разрушаются почвенными микроорганизмами. Однако они являются неселективными и ингибируют рост как сорняков, так и всех культурных растений.

Устойчивость растений к гербицидам может возникать различными путями. Она может быть результатом точечных мутаций генов, кодирующих белок-мишень для данного гербицида. Такие мутации описаны по устойчивости к гербицидам, которые действуют на фотосинтез растений и синтез аминокислот. Эти мутации и являются причиной появления на полях устойчивых сорняков, что приводит к необходимости ротации гербицидов через определенное количество лет, когда устойчивые сорняки накапливаются в количествах, могущих снизить эффективность применения данного гербицида.

Придание растениям устойчивости к тем или иным гербицидам осуществляется разными способами, например путем введения генов, кодирующих белки, не чувствительных к данному классу гербицидов (например, к глифосату, хлоре ульфуроновым и имидазолиновым гербицидам) либо обеспечивающих ускоренный метаболизм гербицидов в растениях (например, глюфосината аммония, далапона).

Устойчивость к глюфосинату аммония. Действующее вещество гербицидов, полученных на основе глюфосината аммония, – фосфинотрицин, ингибирующий глутаминсинтетазу растительных клеток, что приводит к быстрому истощению запаса глутамина в растении, накоплению аммиака, отравлению и гибели растения. Ген устойчивости к глюфосинату кодирует синтез фермента фосфинотрицин ацетилтрансферазы. В результате растение, в которое введен этот ген, обладает способностью продуцировать фосфинотрицин ацетилтрансферазу, разрушающую глюфосинат аммония, и устойчиво к действию данного гербицида.

Устойчивость к глифосату. В настоящее время самый широко применяемый гербицид в мире – глифосат, что повлекло за собой создание ГМ растений, обладающих устойчивостью именно к нему. Он относится к неселективным гербицидам. Механизм его действия основан на ингибировании активности фермента, который катализирует ключевую реакцию в синтезе ароматических аминокислот. В трансгенное растение встроен ген, кодирующий синтез этого же фермента, но не чувствительного к действию глифосата. При его воздействии все растения, не имеющие данного гена, погибают, в то время как ГМ культура нормально развивается.

Устойчивость к гербицидам может быть связана также с амплификацией генов устойчивости. Отселектирована клеточная линия табака, устойчивая к сульфонилмочевинным и имидазолиноновым гербицидам. Фермент-мишень ацетогидоксикислая синтаза этой линии была в 50-780 раз менее чувствительна к гербицидам, чем фермент дикого типа. С помощью гибридизации по Саузерну установлено, что амплификация одного из генов, кодирующих мутантный фермент, достигала примерно 20 копий.

Определена природа устойчивости мутантного фермента, связанная с заменой пролина в 196 положении на серии.

Фермент ацетолактатсинтаза (ALS) является мишенью для ряда гербицидов: сульфонилмочевин, имидазолинонов и триазолпиримидинов. Проведено клонирование гена ALS, его мутагенез in vivo и in vitro и трансформация гербицидустойчивого гена в растения рапса с помощью агробактерии. Отбор по устойчивости к канамицину и непосредственно по устойчивости к хлорсульфурону привел к появлению гербицидустойчивых растений.

Проведены полевые испытания трансгенных линий табака по чувствительности к сульфонилмочевинным гербицидам. В отсутствии обработки гербицидами обе трансгенные линии уступали контролю по урожаю.

При трансфекции протопластов табака геномной ДНК мутанта арабидопсиса, устойчивого к хлорсульфурону, толерантные каллусные линии получены с частотой 4,7x10"*.

Глифосат является активным ингредиентом неселективного гербицида Раундап. Он ингибирует синтез ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан) у бактерий и растений, а аrоА ген кодирует фермент-мишень EPSP синтазу (З-энолпирувилшикимат-5-фосфат синтазу), на которую действует глифосат.

Доказательством подобной функции было клонирование аrоА гена Escherichia coli – при его введении в мультиколийные плазмиды наблюдалась 5-17 кратная суперпродукция EPSP синтазы и, как следствие, 8 кратное повышение устойчивости к глифосату. Из кишечной палочки клонирован ген, введение которого в табак привело к получению устойчивых к глифосату растений.

При получении трансгенных растений петунии (Petunia hybrida) с высоким уровнем экспрессии аrоА гена они были устойчивыми к глифосату. Линия сои с агробактериальным геном, слабо чувствительным к глифосату, была очень устойчива к гербициду в полевых условиях, перенося обработку до 1,68 кг/га глифосата без видимых повреждений.

Клонирован также ген фермента глифосатоксидоредуктазы, превращающий глифосат в нетоксичное соединение – аминометилфосфоновую кислоту.

Комбинация двух генов СР4 и GOX использовалась фирмой Монсанто в качестве селектируемых генов при трансформации кукурузы и некоторых двудольных. При микробомбардировке незрелых зародышей микрочастицами вольфрама, покрытыми ДНК плазмиды, несущей СР4 и GOX гены, получены трансгенные растения пшеницы, устойчивые к коммерческим концентрациям глифосата.

В настоящее время изучен ряд штаммов стрептомицетов, которые в качестве вторичного метаболита продуцируют антибиотик биалафос. Биалафос (фосфинотрицин) был впервые выделен в культуре бактерий Streptomyces viridochromogenes в 1972 г. Он представляет собой трипептид и состоит из фосфинотрицина и двух остатков аланина. Биалафос был выделен также из одного штамма Streptomyces hygroscopicus.

Гербицид биалафос (фосфинотрицин) ингибирует глютаминсинтетазу. Ваr ген кодирует фермент, который ацетилирует гербицид, превращая его в нетоксичное соединение. Трансгенные растений с bar-геном приобретают устойчивость к данному гербициду.

Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам, используют все шире. Добавление всего одного гена приводит к тому, что растения приобретают устойчивость к гербициду, и обрабатывать посевы становится неизмеримо легче. Нелишне подчеркнуть, что речь идет об «экологически щадящих» гербицидах. Современное сельское хозяйство нельзя себе представить без гербицидов, поэтому ставка должна делаться на те из них, которые быстро разлагаются микроорганизмами в почве. К примеру, разработанный компанией «Монсанто» популярный гербицид «Раундап» примерно через неделю после опрыскивания полностью разлагается микроорганизмами в почве. Важно и то, что при этом удается избежать излишней вспашки, сохраняя структуру почвы и защищая ее от эрозии.

В создании растений, устойчивых к гербицидам, сейчас используют два основных принципа, через которые обеспечивается реализация задачи.

Гиперэкспрессия – значительное повышение синтеза продукта, против которого направлено действие гербицида. В этом случае при использовании гербицида в дозах, летальных для других растений, в ГМ растениях будет ингибирована только часть данного продукта. Оставшегося количества будет достаточно для поддержки функций организма. Поэтому гербицид не окажет на растение летального действия. Примером реализации такого подхода явилась работа (Lermontova, Grimm, 2000) по созданию растений табака, устойчивых к ацифлуорифену. Данный гербицид ингибирует фермент протопорфириноген IX оксидазу (РРОХ), участвующий в синтезе хлорофилла. Авторами было идентифицировано у табака два гена: один – РРОХ-1, кодирующий хлоропластный фермент, и РРОХ-2, кодирующий митохондриальный фермент. После этого растения табака были модифицированы генно-инженерной конструкцией, содержащей ген РРОХ-1, что обеспечивало высокий уровень его синтеза в молодых листьях. В результате трансгенные растения имели повышенный уровень содержания данного фермента, который коррелировал с их повышенной устойчивостью к ацифлуорифену.

Другим путем создания устойчивых к гербициду растений является поиск генов, которые не ингибируются данным гербицидом, и последующее внедрение их в геном культурных растений. В этом случае культура не будет реагировать на использование гербицида вообще, в то время как сорняки будут погибать. Примером данного подхода может служить трансформация путем гомологичной рекомбинации в геном пластид табака гена петунии, обеспечивающего устойчивость к глифосату (Daniell et al. 1998).

Специфической проблемой создания и использования генетически модифицированных культур, устойчивых к гербицидам, является предотвращение возможности переноса генов устойчивости к сорным растениям путем переопыления с дикими родственниками. Интересный подход в решении этой проблемы – использование техник, позволяющих целенаправленно встраивать генно-инженерные конструкции в ДНК цитоплазм этических органелл (митохондрий и пластид). Гены цитоплазматических органелл наследуются нехромосомно по материнской линии. Поэтому они не могут быть переданы с пыльцой диким родственникам, с которыми способна скрещиваться данная культура. Об успешном эксперименте в этом направлении сообщено Daniell et al. (1998).

Здесь была успешно проведена встройка путем гомологичной рекомбинации гена EPSPS петунии, который обеспечивает устойчивость к глифосату, в пластиды табака. ГМ растения окэззлись устойчивыми к гербициду, в то время как контрольные погибли в течение двух недель после обработки.

Площади возделывания ГМ растений, одновременно устойчивых к гербицидам и насекомым, увеличились с 0,1% в 1997 г. до 1% в 1998 г.

Примерами этой группы могут быть кукуруза и хлопчатник, устойчивые к Раундапу и одновременно устойчивые к кукурузному мотыльку и хлопковой совке соответственно.