Текст книги "Кризис аграрной цивилизации и генетически модифицированные организмы"
Автор книги: Валерий Глазко
Жанр:
Биология
сообщить о нарушении
Текущая страница: 5 (всего у книги 19 страниц)
Обычно для получения новых сортов и пород животных используют гибридизацию и методы радиационного и химического мутагенеза. Среди проблем, ограничивающих возможности традиционной селекции, можно выделить следующие: желательные гены передаются вместе с нежелательными; приобретение одного желательного гена сопровождается часто потерей другого; некоторые гены остаются связанными друг с другом, что значительно затрудняет отделение положительных свойств от вредных.
Методы радиационного и химического мутагенеза, применяемые в ежедневной практике селекционера, ведут к появлению огромного количества неизвестных генетических перестроек. Выведенное в результате таких воздействий растение в случае, если оно жизнеспособно и не имеет выраженных токсических свойств, может нести невыявленные мутации, поскольку мутантные сорта исследуются лишь с целью изучения характеристик, имеющих отношение к решению конкретной селекционной задачи.
Главные достоинства методов генетической инженерии заключаются в том, что они позволяют передавать один или несколько генов от одного организма другому без сложных скрещиваний, причем донор и реципиент не обязательно должны быть близкородственными. Это резко увеличивает разнообразие изменяемых свойств, ускоряет процесс получения организмов с заданными свойствами, а также, что очень важно, облегчает прослеживание генетических изменений и их последствий. А самое главное, измененный сорт или порода сразу адаптирован – вписан в конкретные условия окружающей среды.
Представить завтрашний день сельского хозяйства трудно, но с большой определенностью можно говорить о стратегических задачах, которые хотелось бы решить. Тут надо понимать, что цели природы и человека различны. Для людей, скажем, выгоднее получить пшеницу или ячмень с крупным зерном, с легкой обмолачиваемо с тью. Природе же важнее не размер, а количество зерен; а вот склонность к легкому обмолачиванию – этот признак может оказаться для растения даже вредным.
Такой разнобой во взглядах природы и человека, могущество которого все возрастает, не может не сказаться губительно на биосфере. Из огромного разнообразия растений, кормивших человека 10 тысяч лет назад, сегодня основу питания (85%) составляет всего пять видов растений. А из 5 тыс. окультуренных видов растений человек в настоящее время для удовлетворения 90% своих потребностей в продовольствии использует лишь 20, из которых 14 принадлежит всего лишь к двум семействам.
Чтобы понять, как далеко зашли эволюционные изменения под влиянием селекционной работы человека, достаточно взглянуть на кукурузные початки (их возраст – 5 тыс. лет), найденные при раскопках в пещере Теуакан (Мексика). Они примерно в 10 раз меньше, чем у современных сортов. И это реальный пример работы генетиков и селекционеров.
Г.Д. Карпеченко (1927) впервые синтезировал новую неизвестную в природе видовую форму Raphanobrassica (рафанобрассика), константный полиплоидный межродовой гибрид между редькой и капустой. Совершенно справедливо Н.Н. Воронцов (1999) называет синтез рафанобрассики первым случаем конструирования нового генома, того, что в конце 70-х стало называться генетической инженерией.
Через три года шведский генетик Арне Мюнтцинг впервые осуществил ресинтез дикорастущего в природе аллополиплоидного вида багульника.
Природная хромосомная инженерия создает гибридогенные полиплоидные комплексы видов, открытые и изученные американским ботаником Ледьярдом Стеббинсом. В этих комплексах геномы нескольких диплоидных исходных видов могут вступать между собой во всевозможные гибридные аллотетраплоидные комбинации. Объединяться могут сразу несколько геномов, так что предком одного вида может ни один, а несколько видов, как, например, у обычной мягкой пшеницы, у видов хлопчатника.
Гибридогенное видообразование встречается и у позвоночных и беспозвоночных животных. Но животные размножаются половым путем, который у межвидовых гибридов затруднен или даже невозможен. Поэтому межвидовые гибриды животных размножаются необычными способами, которые мы могли бы назвать репродуктивными технологиями. К ним относятся: партеногенез (спермии не нужны для развития яйцеклеток видов-гибридов); гиногенез (спермии нужны лишь для активации развития, но развитие происходит на основе женских гамет и наследование матроклинно); и собственно гибридогенез, когда гибридный вид образуется на основе гибридных оплодотворенных яйцеклеток, но один из родительских геномов избирательно устраняется.
Благодаря, в частности, селекционной работе, древнее природное разнообразие местных видов заменено ныне небольшим числом специально выведенных и почти насильно внедряемых сортов, выращиваемых на обширнейших пространствах. 96% урожая гороха в США получается всего-навсего от двух его разновидностей, а 71% урожая кукурузы – от шести ее сортов. Великолепные по продуктивности растения используют, но они, к сожалению, становятся все более подверженными различным заболеваниям, таким, к примеру, как картофельная гниль. Растения приходится усиленно «лечить» пестицидами и прочими опасными для окружающей среды и самого человека средствами. Одна из важнейших целей ДНК-технологии – не менять среду под растения, а наоборот – менять растение таким образом, чтобы оно было наиболее адаптивным к этой среде. Кроме того, необходим возврат растительного царства к многообразию, к неоглядному богатству видов. Очевидно, однако, что при этом главным остается обеспечение доступа к продовольствию всех социальных групп населения («здоровье нации»), поскольку на покупку продовольствия расходуется до 70% доходов населения
Селекционеры, наблюдая за работой биоинженеров, испытывают чувство зависти от простоты и ясности экспериментов. Хотя многие из них считают, что генетическая инженерия – это своего рода увлечение, мода, что она пройдет, и никакой особой пользы практика от нее не получат.
Медлительные, терпеливые, упорные, свято соблюдающие правила, издавна декретированные природой, деревенского, так сказать, склада селекционеры подозрительно относятся к поспешным, явно урбанистическим методам биоинженерии. Их раздражают рвение, спешка, рекламный шум, чрезмерные обещания, явное желание нарушить ритуалы, поскорее опрокинуть поставленные природой барьеры, обойти их, пролезть с «черного хода», зайти «вне очереди». Этот старый спор между сельской неторопливостью, основательностью и городской суетой и необязательностью, видимо, разрешится не скоро, потому что биоинженер, в конечном итоге, передает свои находки селекционерам, именно они должны судить, удался или нет очередной генный «фокус».
Каких бы чудес ни напридумывали молекулярные биологи, рассуждают селекционеры, нам решать, что у них получилось. Потому-то скоростные методы переделки сельского хозяйства – это миф. Для получения у данного растения нужных признаков требуется от пяти до пятнадцати лет. А потом еще, по крайней мере, от трех до восьми лет работы традиционными методами, чтобы закрепить эти признаки у растения, а потом его районирование и тд. Но следует признать, что биоинженерия в отличие от традиционных методов селекции обладает наибольшей возможностью технологизировать достижения фундаментальных знаний, и, в частности, молекулярной биологии. Кроме того, методы биотехнологии являются качественно новым инструментом для непосредственного изучения структурно-функциональной организации генетического материала. А это, в свою очередь, позволяет предположить, что генетическая инженерия растений окажет наибольшее влияние при селекции на такие адаптивно и хозяйственно ценные признаки, как интенсивность чистого фотосинтеза, индекс урожая и др. Наиболее перспективные направления в области защиты растений включают получение трансгенных сортов, устойчивых к гербицидам и вредным видам, биопестицидов, новых форм микроорганизмов и др. Очевидно также, что сама генетическая инженерия, став экспериментальным полигоном эволюции, будет непрерывно совершенствоваться и усложняться, расширяя возможности человека в целенаправленном преобразовании организмов, и вполне вероятно, что дальнейшее развитие методов молекулярной биологии, в том числе трансгеноза, позволит поднять современную селекцию растений на качественно новый уровень.
Хотя для генетической инженерии существует масса трудностей, например, в том, что селекция новых сортов затрагивает свойства растения, контролируемые не одним, а сразу многими генами. Например, ученые хотят сконструировать растения, способные сами себя «удобрять».
Настойчиво пропагандируется мысль передать зерновым культурам – основной пище человечества – группы генов nrf из бактерий, умеющих улавливать атмосферный азот, и тем самым избавиться от необходимости вносить в почву азотные удобрения. И это будет. Но когда – пока неизвестно, потому что переносить необходимо целый комплекс по крайней мере из 17 генов. И если будет все удачно, заставить работать все эти гены (например, в геноме пшеницы), то, по оценкам специалистов, такие растения снизят урожайность на 20-30 процентов сухого веса из-за необходимости нести дополнительные энергозатраты на фиксацию азота...
Проблема производства и потребления генетически модифицированных растительных продуктов становится все более острой. Сторонники широкого употребления в пищу подобного рода изделий говорят, что они совершенно безопасны для человеческого организма, а преимущества их огромны – большие урожаи, повышенная устойчивость к переменам погоды и вредителям, лучшая сохранность. В то же время, в геноме растений есть дальние связи между генами, и вмешиваться в работу генной машины следует очень осторожно. Можно ненароком перевести генные механизмы растения из одного режима в другой, вовсе нежелательный для человека.
Хотя и в традиционной селекции масса таких примеров, не говоря уже о том, сколько селекционеров вообще ничего не получили. Известна, например, история с геном opaque 2. Этот ген захотели использовать в США (университет Пардью) для обогащения зерен кукурузы аминокислотой лизином, что резко бы повысило питательную ценность кукурузного зерна.
Перенос гена удался, радость была великая, но... урожайность у трансформированных сортов упала на 15 процентов, а сами зерна стали хрупкими и чувствительными к возбудителям болезней. Конечно же, очень жаль, что и вооруженная генно-инженерными методиками селекция не может одномоментно решить все проблемы, однако она гарантирует хотя и скромные, но прочные, непрерывные и эффективные успехи в сельском хозяйстве.
Интенсивный путь развития аграрной цивилизации
Новый взгляд на эволюцию. «Генетическая инженерия» в природных экосистемах
Следует подчеркнуть принципиально важное обстоятельство: одно из важных положений современной генетики состоит в открытии способности наследственной системы к «естественной генетической инженерии». В клетке существует режим генетического поиска и реорганизации структуры и функции генома.
Термин «вирус» этимологически обозначает «яд». Вплоть до 60-х годов XX века вирусы преимущественно рассматривались как болезнетворное начало. Но изучение вирусов многоклеточных организмов и бактерий (бактериофагов), открытие большого сходства мобильных генетических элементов с вирусами, а затем выявление повсеместного распространения вирусных последовательностей в геноме каждого изученного вида млекопитающих изменило представление о вирусах.
Представление о повсеместности вирусов в биосфере, высказанное в середине 70-х годов (Жданов, Тихоненко, 1975), в настоящее время полностью подтверждено. Вирусы вездесущи. Может быть, именно поэтому их можно обнаружить при любом заболевании (у здоровых их, как правило, не ищут). У человека только в клетках кишечника число обнаруженных в норме и при патологии вирусов больше 120. К 1970-м годам стала ясна суть респираторных – «простудных» заболеваний, переносимых большинством горожан, которые являются отражением эпидемических вспышек размножения вирусов.
Целенаправленное изучение путей распространения вирусов в природе привело в начале 80-х годов XX века к получению новой информации. Например, такие вирусы, как вирус полиомиелита, которые из-за своего видимого патогенного эффекта считались исключительно нейротропными, оказались обнаруженными в сточных водах и, стало быть, входят в группу энтеровирусов. Сточные воды оказались источником вспышки одной из форм вирусного гепатита, детского гастроэнтерита.
Пути распространения вирусов в биоценозах, и соответственно, пути горизонтального межвидового переноса генетического материала, поразительны. Достаточно сказать, что РНК-содержащий вирус гриппа переносится водоплавающими перелетными птицами, но обнаружен и у китов и у планктонных организмов (Жданов, 1990).
В эволюционном аспекте вирусы в природе являются самым мощным селективным фактором и самым мощным генератором наследственного полиморфизма, возникающего в результате популяционно-генетических взаимодействий типа паразит-хозяин.
Другой важный фактор в эволюции – бактерии. Миллиарды лет бактерии были единственными обитателями биосферы. Ни человека, ни животных, ни высших растений не было на Земле, а бактерии уже были. Да они и сейчас настоящие «хозяева планеты». Бактерии – истинные космополиты: они завоевали толщи почв и все водные бассейны, они поселились и в нас самих. Они создавали и создают месторождения полезных ископаемых, они же превращают останки живых существ в материал для новой жизни, помогают нам переваривать пищу и готовить ее. Они способны и убивать нас, заразив болезнями. Биомасса этих мелких существ на много порядков превышает биомассу всех земных млекопитающих вместе с человеком.
Горизонтальный перенос генов от одного организма в другой являлись существенным механизмом эволюции, в основном, у бактерий. Этот факт стал очевидным в последние несколько десятилетий.
Джошуа Ледерберг в 1952 году ввел понятие «плазмида». Он обнаружил в кишечной палочке, кроме основной спиралевидной, вытянутой во весь свой немалый рост ДНК, еще и маленькие, свернутые в кольцо ДНК. О плазмидах заговорили медики, когда в 1959 году было доказано, что неэффективность многих антибиотиков обусловлена плазмидами, несущими гены устойчивости к антибиотикам. Плазмиды легко переходят от бактерии к бактерии, делая их невосприимчивыми к лекарствам. К примеру, вырабатываемый плазмидами фермент пенициллаза разрушает пенициллин, спасая бактерии от гибели. Что, конечно же, осложняет лечение больных.
Детальные наблюдения характера возникновения опосредованной плазмидами устойчивости сделаны в Японии и Англии. В 1945 г. в Японии для борьбы с дифтерией стали применять сульфаниламид. Он был высокоэффективен только первые 5 лет. Вскоре появились устойчивые штаммы дифтерийной палочки, а уже некоторое время спустя 80-90% изолятов были устойчивыми. Затем сульфаниламид заменили антибиотиками. Но уже в 1952 г. от больного дифтерией был выделен штамм дифтерийной палочки, одновременно устойчивый к тетрациклину, стрептомицину и сульфаниламиду. А в 1964 г. половина всех бактериальных штаммов, выделенных из больных дифтерией, несла гены устойчивости одновременно к четырем антибиотикам. Эти гены устойчивости были собраны в одной плазмиде, способной распространяться среди бактерий горизонтально.
Гены плазмид, в свою очередь, могут перекочевывать на хромосомы клеток-реципиентов. Считают, что таким путем в кишечную палочку попали гены, кодирующие ферменты инактивации антибиотиков. Возможно, эти гены впервые появились у почвенных бактерий, живущих рядом с грибами-продуцентами антибиотиков. В почвенных бактериях в геноме плазмид находятся детерминанты устойчивости к тяжелым металлам. Из природных резерватов плазмиды с транспозонами, несущие гены устойчивости, попадают к бактериям животных и человека и с помощью их распространяются по всему миру.
То, что затрудняло работу медиков, пригодилось генным инженерам. А им нужны были переносчики реконструированных молекул ДНК в живые объекты. Правда, вначале на эту роль прочили вирусы-бактериофаги. Но, проникнув в клетку, вирус ведет себя как опасный хищник. Он переключает ресурсы клетки на удовлетворение своих нужд и примерно через полчаса губит ее. Иначе поступает плазмида – в отличие от вируса, она не убивает клетку-хозяйку. Плазмида и приютившая ее клетка осуществляют симбиоз. Плазмида защищает бактерию от, например, пенициллина. Клетка предоставляет плазмиде ресурсы для питания, размножения. Все эти особенности симбиоза бактерий и плазмид (особенно способность плазмид переходить «из рук в руки», от одной клетки к другой) оказались источниками генно-инженерных методов.
Плазмидами Д. Ледерберг предложил обозначать все внеядерные генетические элементы, способные к автономной репликации. Сюда входят «каппа-частицы» у парамеций, экзогенные вирусы и т.д. Взгляд на плазмиды как на симбионты и альтернативный взгляд на них как на составную часть генома, согласно Д. Ледербергу, зависит от того, насколько широко исследователь трактует границы генома и наследственной системы организма.
Именно особенности жизненных циклов вирусов, плазмид и бактерий привело в дальнейшем к созданию так называемых «векторов» – искусственно сконструированных молекул наследственности, которые могут переносить чужеродный материал от одного организма к другому.
Какие генно-инженерные приемы подсмотрены в природе
Благодаря перемещающимся элементам, генофонды всех организмов потенциально составляют общий генофонд всего живого. Реализация этой потенции, т.е. передача генов между разными таксонами, детально документирована. У млекопитающих и птиц практически идентичные провирусные последовательности появились уже после их эволюционного обособления. Поток генов между далекими организмами является реальностью. Вопрос заключается только в том, насколько часто организмы присваивали чужеродные гены в качестве «благоприобретенных собственных функциональных генов».
Наглядным примером горизонтального обмена между прокариотами и высшими эукариотами являются результаты исследований представленности в прокариотических геномах нуклеотидных последовательностей, типичных для эукариот (табл.1). Из этой таблицы следует, в частности, что в геноме симбионта человека, кишечной палочки, примерно 17% ДНК имеет эукариотическое происхождение. Хорошим примером естественной генетической трансформации является агробактериальная трансформация растительных клеток. Отличительная черта бактерий рода Agrobacterium (A.tumefaciens, A.rhizogenes) – способность вызывать развитие так называемых корончатых галлов (своего рода опухолей) у большого круга двудольных растений. При этом происходит перенос фрагмента ДНК агробактерии в геном растительных клеток. Такая клетка со встроенным участком агробактериальной ДНК продуцирует ряд органических веществ, служащих для агробактерии специфическими источниками углерода и азота. Такой перенос – уникальный природный процесс обмена генетической информацией между бактерией и растением, и именно его ученые взяли на вооружение для получения трансгенных растений, встраивая целевой ген в участок агробактериальной ДНК, переносимый в растение.
Эффективность трансформации растительных клеток может быть увеличена за счет использования штаммов A.tumefaciens, обладающих повышенной вирулентностью по отношению к данному виду растений. Тем не менее, частота трансформации весьма низка – только одна из 10 тысяч растительных клеток становится носителем рекомбинантной ДНК.
Возможно около 20 способов проникновения и межвидовой миграции генетических элементов, в их числе трансформация, трансдукция, перемещение транспозонов, плазмид, вирусов, неполовой обмен хромосомами и образование симбиотических ассоциаций. Информационная емкость переноса информации, выраженная в генах, варьирует от единиц до сотен и тысяч в случае плазмид и симбионтов.
Под влиянием стресса резко увеличиваются частоты горизонтального обмена материалом наследственности между бактериями, у растений – частоты перекрестного опыления у самоопылителей. В последние годы в различных моделях стресса у многих видов высших организмов наблюдают увеличение частот рекомбинационных событий, транспозиций, различных мутационных событий. Отчетливые данные о связи дестабилизации генетического материала с действием стрессирующих факторов, полученнные Б. МакКлинток, впоследствии привели к развитию представлений о системах «природной генетической инженерии» (Shapiro. 1992,1995).
Изначально термин «генетическая инженерия» применяли для обозначения целенаправленной манипуляции наследственными детерминантами с целью изменения существующих видов. В настоящее время этим термином обычно обозначают генетические манипуляции, с помощью которых формируется организм, имеющий новую комбинацию наследуемых признаков. Иначе ДНК-технологии можно определить как отрасль биологии, которая изучает явления и конструирование наследственности и изменчивости. Современный этап ДНК-технологий неразрывно связан с необходимостью увеличения источников благосостояния и здоровья человечества. ДНК-технологии стремительно увеличивают наши знания в одной из наименее исследованных областей – наследственности и законов ее изменения естественным и экспериментальным путем.
Свыкшись с материальностью генов, человек, естественно, тут же захотел заняться генной хирургией. Для этого в природе имеются ферменты рестриктазы, с высокой точностью разрезающие молекулу ДНК в определенных сайтах (сочетаниях нуклеотидов), и ферменты лигазы, «сшивающие» такие разрывы. Именно эти ферменты послужили основой для создания строго запланированных генных конструкций.
Использование рекомбинантных (перестроенных) ДНК различного происхождения составляет основу ДНК-технологий. Теоретически все 30-40 тысяч структурных генов человека и животных доступны теперь экспериментальному анализу. Поэтому желательна идентификация всех генов; составление карты тканеспецифичности их экспрессии; идентификация регуляторных областей генов; построение глобальной регуляторной карты генома; классификации генов по структурным и биохимическим функциям их продуктов; идентификация всех потенциальных белков и доменов; анализ распределения полиморфизма и мутаций; определение эволюционных и популяционных взаимосвязей; создание коллекции генетического материала и тд.
Устойчивость нити ДНК в составе хромосом регулируется целой системой ферментов, контролирующих три матричных процесса – репликацию, транскрипцию и трансляцию, и три собственно генетических процесса – репарацию, рекомбинацию и сегрегацию нитей ДНК и хромосом. Белковые продукты «генов метаболизма ДНК» образуют комплексы, которые следят за устойчивостью нитей ДНК, надежностью их репликации и рекомбинации, корректируют однонитевые и двунитевые повреждения. Степень активности этих комплексов весьма чувствительна к физиологическому статусу клетки. Ю.Я. Керкис (1940) впервые показал, что спонтанные наследственные изменения возникают за счет нарушения внутриклеточного метаболизма и физиологического гомеостаза. Устойчивость ДНК и темп мутаций могут в случае клеточного стресса меняться в десятки и сотни раз.
Началом эры генной инженерии растений принято считать 1973 год, когда впервые был проведен целенаправленный перенос гена. Фактически генная инженерия продолжает направление традиционной селекции сельскохозяйственных культур, однако достигает поставленных целей намного быстрее. Основные отличия генетической инженерии от традиционной селекции заключаются в том, что улучшение свойств культурных растений достигается либо улучшением существующей, либо созданием новой генетической вариации. При использовании традиционных методов скрещивания гарантия получения искомой комбинации генов, то есть желаемого признака у растения, практически отсутствует.
Прогресс современной науки во многом определяется и в решающей степени зависит от экспериментальной и практической реализации новых идей и подходов в клеточной и молекулярной биологии. Химерные и трансгенные животные и растения – это наиболее яркое подтверждение потенциальных возможностей фундаментальной и прикладной науки. Такие организмы стали основными инструментами в исследованиях функций генов, процессов дифференцировки, эмбрионального развития, клеточной гибели и старения. Несомненный прорыв в деле создания химерных и трансгенных организмов связан с разработкой ЭСК-технологий и микрохирургической техники работы на изолированных зародышах. В этих технологиях эмбриональные стволовые клетки стали связующим звеном между системами in vitro и in vivo, что дало возможность легко переносить результаты исследования с клеточного уровня на уровень целого организма. При этом значительно повысилась эффективность метода трансгеноза – до 40-50% по сравнению с 1% при использовании техники инъекции чужеродной ДНК (генов) в пронуклеусы зародыша на стадии зиготы.
ДНК-технологии позволяют исследовать и направленно изменять материал наследственности на разных уровнях его организации – генном, хромосомном, геномном, популяционно-генетическом. Интересно, что в смысле управления наследственностью «генетическую инженерию» использовали в течение тысячелетий безымянные селекционеры, благодаря которым еще в эпоху неолита и было введено в культуру абсолютное большинство возделываемых в настоящее время видов растений.
Переходя непосредственно к описанию методов генетической трансформации, отметим, что на сегодняшний день молекулярная генетика располагает значительным набором знаний и приемов для осуществления переноса генов из одних организмов в другие. Технология создания трансгенных растений включает большое количество этапов, среди которых можно выделить: получение целевых генов, создание векторов; трансформацию растительных клеток; подтверждение трансформации молекулярно-биологическими методами – обнаружение функционирующего целевого гена; регенерация целого растения из трансформированных клеток.
Подготовительный этап: конструирование вектора. На первом этапе конструирования рекомбинантной ДНК готовят вставки, пригодные для последующего соединения с вектором. В настоящее время наиболее часто используются 3 метода их получения: из фрагментов геномной ДНК; путем ферментативного или химического синтеза фрагментов ДНК; из сегментов ДНК, полученных с помощью ферментативного копирования РНК-матрицы in vitro.
В качестве вектора, которым может быть любой небольшой внехромосомный элемент (плазмида, ДНК фага или вируса), для трансформации растительных клеток обычно используют бактериальные плазмиды.
Следует отметить, что в большинстве случаев целевой ген подвергается модификации, поскольку, несмотря на универсальность генетического кода (он одинаков для всех организмов вне зависимости от уровня их организации), состав триплетов, кодирующих одни и те же аминокислоты у организмов, принадлежащих к разным видам, имеет некоторые отличия.
Замена кодонов никоим образом не сказывается на первичной структуре белка, в то время как экспрессия гена может быть усилена в сотни раз. Необходимый уровень экспрессии целевого гена в клетках растения достигается посредством использования соответствующих регуляторных элементов, контролирующих работу гена, – промоторов и терминаторов.
Следует отметить, что среди известных в настоящее время промоторов один из самых сильных – промотор 35S вируса мозаики цветной капусты, поэтому в большинстве случаев именно его используют в качестве регулятора экспрессии целевого гена.
Таким образом, вносимая генетическая конструкция (вставка или кассета экспрессии) – это группа функционально связанных участков ДНК, состоящая из высокоактивного промотора, непосредственно за которым располагаются соответствующий целевой ген и терминатор транскрипции. После получения вектора и вставки начинается процесс конструирования рекомбинантной ДНК. Полученные молекулы ДНК вводят в бактериальные клетки для клонирования, что приводит к накоплению рекомбинантной ДНК. Эффективное увеличение количества ее копий возможно лишь при обеспечении оптимальных условий существования вектора, использующего метаболиты, ферменты и другие белки клетки-хозяина, а также ее аппарат белкового синтеза, поэтому основной инструмент молекулярного клонирования – совместимая комбинация хозяина и вектора. Наиболее широко применяются такие сочетания, когда в роли хозяина выступает штамм E.coli, а в роли вектора – его плазмида. Проникновение вектора в живые клетки E.coli проходит наиболее эффективно при условии повышенной проницаемости клеточных мембран, обусловленной, например, их локальным разрушением. Нарушение их целостности достигается либо воздействием электрического тока – электропорацией, либо посредством обработки клеток определенными химическими веществами, после чего перенос вектора происходит в течение нескольких минут. Векторы обычно содержат маркерные гены, благодаря которым осуществляется отбор клеток с измененным генотипом. Например, клетки, чувствительные к определенному антибиотику или токсину, можно использовать в комбинации с векторами, содержащими гены устойчивости к этим агентам. Выращивая микроорганизмы в условиях, при которых проявляется зависимость от маркерных генов, можно отобрать и размножить клетки, несущие требуемый генетический материал.
