Текст книги "Биохимия старения"

Автор книги: Роберт Сапольски

сообщить о нарушении

Текущая страница: 9 (всего у книги 19 страниц)

Глава 4. Изменения коллагена

Введение

Коллаген – это структурный белок, имеющий волокнистое строение. Он является самым распространенным белком в животных организмах и составляет 20–25 % всего содержания белков. Он синтезируется в клетках всех типов, однако откладывается в тканях во внеклеточном пространстве. Некоторые ткани, например сухожилия и связки, состоят в основном из коллагена. Следовательно, изменение этого белка с возрастом играет важную роль в процессе старения. Поэтому Верцар и начал в 50-х годах систематические исследования, целью которых было выяснить, меняются ли свойства этого белка при увеличении возраста животного. Он установил, что бороздчатость сухожилия хвоста крысы и сила термического сокращения сухожилия с возрастом увеличиваются (рис. 4.1), а его растворимость уменьшается [87, 88, 92]. Это свидетельствует о том, что полипептидные цепи коллагена в старческом возрасте имеют повышенное содержание поперечных сшивок. Эти наблюдения привели Верцара к созданию коллагеновой теории старения [89, 90]. Согласно этой теории, увеличение числа ковалентных поперечных сшивок в коллагене при увеличении возраста животного делает белок менее растворимым. Вследствие этого он накапливается в тканях в ущерб клеткам, вызывая нарушения в функционировании органов и всего организма. Эта теория стимулировала исследования молекулярных изменений коллагена и других родственных ему белков как функции возраста. Кроме того, коллаген широко использовали как модельный белок для изучения процесса старения благодаря тому, что его легко извлечь и легко получить в больших количествах из сухожилий и других соединительных тканей. Был опубликован ряд обзоров, посвященных разным аспектам изучения коллагена [4, 5, 10, 11, 21, 24, 27–30, 32, 62, 76, 78, 90].

Рис. 4.1. Влияние возраста на силу сокращения волокон коллагена хвоста крысы при нагревании [92]. По оси ординат отложен вес груза, требующегося для предотвращения сокращения при нагревании волокон, по оси абсцисс – возраст. · здоровые животные; † животные, самопроизвольно умершие

Коллаген – основной компонент всех соединительных тканей. Будучи внеклеточным белком, он не обновляется при делении клеток, и его запас не возобновляется, как это имеет место для внутриклеточных белков. Его растворимость с возрастом животных постепенно уменьшается, как это показано на рис. 4.2 [20]. Кроме того, растет доля тримеров полипептидных цепей по сравнению с димерами и мономерами, что указывает на увеличивающееся число межмолекулярных сшивок (рис. 4.3 и 4.4) [16]. Действительно, увеличение количества нерастворимого коллагена в сухожилии человека с возрастом происходит настолько закономерно, что, измеряя количество коллагена, устойчивого по отношению к коллагеназе, можно определять его возраст [33]. Некоторые физические свойства белка резко меняются. Помимо увеличения напряжения, которое развивается в сухожилии при термическом сокращении при 65 °C (рис. 4.5), возрастает время, которое требуется для его разрыва при определенной нагрузке (рис. 4.6), а время сокращения уменьшается.

Рис. 4.2. Влияние возраста на растворимость коллагена сухожилия хвоста (промытого фосфорной кислотой) в воде при 65 °C в течение 10 мин для интактных крыс (I) и крыс, лишенных гипофиза (II) [20]

Рис. 4.3. Увеличение с возрастом суммарного веса коллагена в сухожилии хвоста и количества нерастворимого коллагена [16]. С помощью гель-фильтрации образцов на биогеле А-15 показано увеличение с возрастом количества нерастворимого коллагена и соответствующее уменьшение α-субъединиц

Рис. 4.4. Распределение α-цепей и коллагена других типов в коже крыс разного возраста [36]

Рис. 4.5. Зависимость веса груза, который может поднять сухожилие крысы при сокращении, от возраста [89]. Предел прочности при растяжении (или сила сокращения) равномерно увеличивается с возрастом

Рис. 4.6. Увеличение с возрастом времени, которое требуется для разрыва изолированного волокна коллагена из сухожилия хвоста крысы в 7 М мочевине при 40 °C и рН 7,0; вес груза 2 г [22]

Коллаген является главным органическим компонентом экстрацеллюлярного матрикса, в особенности соединительных тканей, таких, как кости и хрящи. Он служит как бы «лесами» для клеток при построении этих тканей и выполняет механические и защитные функции.

При старении млекопитающих обычно наблюдаются увеличение числа морщин на коже, уменьшение костной массы и увеличение хрупкости костей, а также изменение физических свойств хрусталика. Происходит ли это благодаря появлению с возрастом новых типов коллагена или благодаря прогрессирующим посттрансляционным изменениям в макромолекулах коллагена, вызывающим потерю функций ткани? Если верна первое, то это может означать, что перечисленные выше изменения свойств коллагена происходят из-за изменений первичных центров, т. е. в пожилом возрасте происходит экспрессия генов, ответственных за синтез нерастворимого коллагена. Если же верно второе предположение, то причина старения имеет вторичный характер. Изменения физических свойств коллагена по мере старения животного в этом случае могут происходить из-за изменений с возрастом уровней эффекторов, что приводит к модификации свойств коллагена уже после его синтеза. Таким образом, для того чтобы разобраться в изменении свойств коллагена как функции возраста, необходимо знать его молекулярную структуру.

Молекулярная структура

Внеклеточный коллаген представляет собой фибриллы, состоящие из нескольких мономеров. Каждый мономер – это тройная спираль из трех полипептидных цепей, свернутых друг относительно друга. В коллагене разных тканей найдено два типа полипептидных цепей – α1 и α2. Цепи α1 имеют четыре варианта – α1(I), α1(II), α1(III) и α1(IV). Четыре варианта α1 и цепи типа α2 различают последовательностью аминокислот и, следовательно, кодируются разными генами.

Каждая α-цепь состоит из ~1050 аминокислотных остатков и имеет мол. массу 100000. Приблизительно 15–25 остатков в каждом из NH₂– и COOH-концевых участков α-цепи имеют последовательность, не свойственную коллагену и не имеющую формы спирали. Эти концевые участки называются: телопептидами. В отличие от центральных спиральных областей цепи, характерных для коллагена, они не содержат Gly в каждом третьем положении. На NH₂-конце находится пептид Lys₉, сохранившийся в ходе эволюции. Он превращается вне клетки в аллизин, принимает участие в образовании поперечных сшивок с α-цепью другого мономера коллагена и, следовательно, в формировании фибриллы. COOH-концевая область также содержит сохранившийся в ходе эволюции Lys₁₀₄₄, участвующий в образовании сшивки внутри мономера и в формировании фибриллы [57].

Центральная часть α-цепи состоит из ~1000 остатков, соединенных в повторяющейся последовательности Gly – X-Y, т. е. Gly занимает каждое третье положение. Таким образом, всего в α-цепи около 337 глициновых остатков, составляющих одну треть всех аминокислот коллагена. Положение X и Y занимают другие аминокислоты. Часто встречаются также аминокислоты пролин (Pro) и оксипролин (Hyp). Pro занимает положение X, а Hyp – положение Y. Обычно Hyp гидроксилирован по четвертому углеродному атому. Разные типы α-цепей отличаются друг от друга аминокислотами в положениях X и Y. Наличие Gly и его присутствие в каждом третьем положении характерны для всех цепей, тогда как содержание Hyp и Pro в разных α-цепях различно.

Чем выше суммарное содержание Hyp+Pro, тем выше температура плавления (T_m) коллагена и его стабильность (T_m – температура, при которой разрушается 50 % спиральной структуры):

В отличие от глобулярных белков α-цепи не имеют водородных связей внутри цепи. Таким образом, в них отсутствуют α-cпирали и они представляют собой β-структуры. Если у глобулярных белков, имеющих α-спиральную структуру, приходится 5,4 аминокислотных остатков на виток, а подъем на один остаток равен 0,15 нм, для α-цепей коллагена эти значения составляют 3,3 остатка и 0,29 нм соответственно. Каждая цепь имеет левые витки с шагом 0,9 нм, содержащим три остатка.

Три α-цепи, уложенные параллельно, образуют тройную спираль мономера коллагена. Вокруг центральной оси они расположены таким образом, что каждая закручена относительно другой влево. Три цепи удерживаются друг возле друга водородными связями. Несмотря на то что энергия Н-связей составляет всего 3–5 ккал/моль, существование большого числа таких связей (две Н-связи на три остатка) обеспечивает удерживание трех цепей рядом, причем именно водородные связи ответственны за структуру тройной спирали. Это оказывается возможным благодаря наличию в каждом третьем положении Gly. У глицина нет боковых групп, а его атом водорода при α-углеродном атоме расположен в пространстве между цепями. Азот иминогруппы Gly одной цепи связан Н-связью с карбонильным (кислородом Gly другой цепи (рис. 4.7). Любая другая аминокислота препятствовала бы образованию Н-связи между цепями и закручиванию цепей. Hyp также образует Н-связи между цепями через молекулы воды и, следовательно, тоже вносит вклад в стабильность мономера [63]. Коллаген, в котором Pro не гидроксилирован, имеет T_m в интервале 20–25 °C. Если Pro гидроксилирован, то T_m коллагена равна 37 °C. Таким образом, структура тройной спирали коллагенового мономера поддерживается в значительной степени благодаря водородным связям.

Рис. 4.7. Водородные связи в тройной спирали коллагена [63]. Предполагается образование водородных связей двух типов: 1) однократно связанных структур между группами NH цепи А и С=О цепи Б; 2) дважды связанных структур с водным мостиком между группой NH цепи Б, связанной водородной связью с кислородом молекулы воды, которая в свою очередь связана с кислородом цепи А. Кроме того, вторая молекула воды связывает атомы кислорода цепи А и цепи Б

Фибрилла коллагена состоит из нескольких мономеров. Мономеры объединяются двумя способами. Они располагаются конец-в-конец, причем NH₂-конец одной цепи обращен к COOH-концу другой. Цепи лежат рядом, но сдвинуты друг относительно друга на 234 остатка, что соответствует 66,7 нм. Этот сдвиг, или период, обозначают "D". Мономеры, расположенные рядом, удерживаются ковалентными поперечными связями, образованными модифицированными лизиновыми остатками. Упомянутый выше сдвиг таков, что Lys₉ α-цепи одного мономера располагается против Lys₉₃₄ α-цепи соседнего мономера; между этими лизинами образуется ковалентная поперечная сшивка, благодаря которой мономеры удерживаются рядом.

Между мономерами, расположенными конец-в-конец, имеется зазор ~30 нм (~0,4D). Поэтому мономер одной линейной последовательности налагается на соседней мономер со сдвигом ~0,4 D. Эти зазоры и наложения чередуются, что выявляется на электронных микрофотографиях фибрилл коллагена в виде светлых (зазор) и темных (наложение) линий. Этим и объясняется бороздчатый вид фибрилл на электронных микрофотографиях (рис. 4.8).

Рис. 4.8. Электронная микрофотография микрофибриллы коллагена, окрашенной фосфорновольфрамовой кислотой [32]. Видна бороздчатость микрофибриллы

Каждый мономер коллагена имеет длину 300 нм и диаметр 1,5 нм. Пять мономеров со сдвигом друг относительно друга D образуют микрофибриллу диаметром ~4 нм. Микрофибриллы закручены в спираль с шагом 70 нм. Несколько микрофибрилл образуют фибриллу, диаметр которой зависит от числа микро-фибрилл [37, 47, 58, 82, 94].

Типы коллагена и их распределение

В тканях встречается коллаген четырех основных типов, характеризующихся разной структурой объединения α-цепей в тройные спирали (табл. 4.1). Коллагену, подобно некоторым ферментам, которые существуют в виде изоферментов, присущ молекулярный полиморфизм. Существует 5 типов α-цепей, и, следовательно, возможно образование 35 разных тройных спиралей. Почему образуются только четыре типа – неизвестно.

Таблица 4.1. Типы, строение, локализация и характеристики коллагена

Жесткие ткани – кости, сухожилия, кожа – содержат коллаген типа I, молекула которого состоит из двух цепей α1(I) и одной α2. Эти мономеры образуют плотноупакованные шероховатые фибриллы, и на их электронных микрофотографиях видны обычные поперечные полосы (рис. 4.8). Это наиболее распространенный тип коллагена у позвоночных. Пластичные ткани – кожа зародышей, гладкие мышцы (матки и пищеварительного тракта), кровеносные сосуды, легкие, связки и хрусталик – кроме коллагена типа I содержат коллаген типа III. В этих тканях коллаген состоит из трех цепей α1(III), а фибриллы расположены хаотически. Соотношение коллагена типа I и типа III в них равно (2–3):1. Коллаген типа III синтезируется на ранних стадиях заживления ран, но по мере созревания рубца его синтез сокращается и постепенно увеличивается синтез коллагена типа I.

В каждой ткани преобладает коллаген какого-либо одного типа. Пульпозное ядро межпозвоночных дисков человека содержит только коллаген типа II, а окружающее ядро фиброзное кольцо – коллаген типа I и II [23]. При некоторых заболеваниях уменьшается доля коллагена типа III [71], Кожа зародыша содержит больше коллагена типа III, чем типа I, а у взрослых соотношение меняется на обратное [19].

Синтез коллагена

Внутриклеточные процессы

В опытах по гибридизации соматических клеток с использованием фибробластов человека и мыши установлено, что гены, ответственные за синтез коллагена типа I и III человека, расположены в разных хромосомах [61]. α-Цепь каждого типа кодируется отдельной моноцистронной мРНК. Следовательно, разные α-цепи кодируются разными генами [18]. Изучение гибридизации РНК-ДНК с использованием кДНК, полученной с помощью мРНК для про-α-цепей, показало, что для α-цепи каждого типа есть только один ген [26]. мРНК для про-α-цепи содержит ~4500 нуклеотидов и имеет на 3′-конце полиадениловый "хвост" длиной ~150 нуклеотидов [35]. Предшественник коллагена – проколлаген (про-α) транслируется с мРНК на полирибосоме в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме примерно за 4,8 мин. Про-α1 и про-α2 синтезируются на отдельных полирибосомах.

Про-α состоит из ~1500 остатков и имеет мол. массу ~150000. Он имеет NH₂– и COOH-концевые участки, NH2-пропептид и COOH-пропептид, к которым присоединены короткие телопептиды в 15–25 остатков (рис. 4.9). Структура этих участков отличается от структуры, свойственной коллагену, и характеризуется отсутствием спиральной конформации.

Рис. 4.9. Биосинтез коллагена. Про-α-цепи синтезируются на полирибосомах. Эти цепи имеют концевые неспиральные участки, в которых нет типичной для коллагена последовательности Gly-X-Y. Про-α-цепи объединяются в клетках в тройную спираль проколлагена за счет образования водородных связей, а затем выделяются в межклеточный матрикс. Специфические пептидазы удаляют с обоих концов проколлагена пропептиды, в результате чего образуется мономер коллагена. Лизиновые остатки модифицируются ферментами и образуют ковалентные связи между цепями. Мономеры коллагена объединяются в микрофибриллы. Мономеры удерживаются друг около друга ковалентными поперечными сшивками между модифицированными лизиновыми остатками. АК – аминокислота

Возможно, NH₂-пропептид сигнализирует о секреции, как это имеет место в случае других секреторных белков. Некоторые пролиновые и лизинговые остатки в ходе трансляции гидроксилируются. Гидроксилирование происходит даже по окончании трансляции. В NH₂– и COOH-пропептидных областях коллагена всех типов присутствуют цистеиновые остатки [34]. Они образуют S – S-связи между цепями и способствуют выстраиванию α-цепей при образовании тройной спирали [60]. Из клетки выходят только правильно построенные тройные спирали. Следовательно, образование S – S-ковалентных связей между цепями помогает не только выстраиванию, но и секреции мономеров [68]. Некоторые гидроксилированные Lys перед формированием тройной спирали гликозилируются [12]. Степень гидроксилирования Pro и Lys и гликозилирования оксилизина (Hyl) соответствует ряду: тип III>тип II>тип I. Время, которое требуется на эти модификации, также подчиняется этому порядку.

Гидроксилирование пролина

Гидроксилирование Pro стабилизирует тройную спираль. Эту реакцию катализирует пролилгидроксилаза [40, 60] – фермент, связанный с шероховатым эндоплазматическим ретикулумом. Фермент, выделенный из куриных эмбрионов, имеет мол. массу 230 000. Он представляет собой тетрамер, состоящий из мономерных субъединиц двух типов – с мол. массой 60000 и 64000 [60]. Мономер неактивен. Молекула фермента имеет сильно выраженные кислотные свойства, ее pI=4,4. Пролингидроксилаза катализирует превращения только пептидилпролина, по отношению к свободному пролину она неактивна. Этот фермент является оксигеназой со смешанными функциями. Для его активирования требуются молекулярный кислород, Fe²⁺, α-кетоглутаровая и аскорбиновая кислоты. Одновременно с гидроксилированием пролина α-кетоглутаровая кислота окислительно декарбоксилируется с образованием сукцината. При этом выделяется CO₂, количество которого измеряют при определении активности фермента. Кислород расходуется в реакции прямого замещения в положении С-4 пролинового остатка. Есть сообщение [52], что аскорбиновая кислота нужна не для самой реакции гидроксилирования, а для последующего восстановления железа в ферменте. Субстраты связываются с ферментом в следующем порядке: Fe²⁺, α-кетоглутаровая кислота, кислород, полипептид. Гидроксилирование происходит только после того, как все четыре субстрата связались с ферментом. Продукты удаляются в следующем порядке: гидроксилированный пептид, CO₂, сукцинат. Аскорбат не расходуется стехиометрически. Он ассоциирует с ферментом либо до связывания железа, либо после удаления одного или двух продуктов [86]. In vitro несколько пролиновых остатков гидроксилируются в отсутствие аскорбата. По-видимому, аскорбат не является необходимым для гидроксилирования [64]. Он требуется для регенерации железа в восстановленной форме. При недостатке аскорбиновой кислоты цепи коллагена гидроксилируются не полностью [8].

Пролиновые остатки гидроксилированы в основном в положении С-4, но в некоторой степени – и в положении С-3. В коллагене типа I и II С-3-гидроксилированный атом встречается только в соотношении 1 на цепь, а в коллагене типа IV-10– 15 на цепь. В реакциях гидроксилирования этих двух видов участвуют два разных фермента [84]. При ингибировании гидроксилирования пролина предотвращается образование тройной спирали мономера и уменьшается ее стабильность. Кроме того, при таком ингибировании коллаген не накапливается в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме и не выделяется из клетки. Гидроксилирование происходит до образования тройной спирали, так как было показано, что она не является субстратом в реакции гидроксилирования [10]. Гидроксилирование пролина можно предотвратить включением его аналогов, ограничением количества кислорода и связыванием железа в хелат. В заключение отметим, что гидроксилирование пролина является ключевым фактором в регуляции биосинтеза коллагена и в формировании его структуры.

Гидроксилирование лизинового остатка

Лизин включается в про-α-цепи в ходе трансляции. Его гидроксилирование катализируется лизилгидроксилазой [48]. Фермент, выделенный из куриных эмбрионов, имеет мол. массу 550000 и 200000 [60]. Как и для пролилгидроксилазы, для его активации необходимы молекулярный кислород, α-кетоглутаровая кислота, Fe²⁺ и аскорбиновая кислота. Обе гидроксилазы имеют близкие значения К_М. Они обратимо ингибируются n-хлормеркурибензоатом (nХМВ), что указывает на участие в катализе SH-групп фермента. Дитиотрейтол увеличивает активность обеих гидроксилаз. Как и гидроксилирование пролина, гидроксилирование лизиновых остатков происходит до образования тройной спирали. Обе гидроксилазы, выделенные из изолированных клеток сухожилия куриных эмбрионов, ингибируются гидрокортизонацетатом [55]. Последний ингибирует также синтез коллагена, причем это ингибирование обратимо. Содержание гидроксилизина (Hyl) различно в коллагене разных типов и с возрастом увеличивается [6]. При недостатке витамина D содержание Hyl в коллагене растет [80].

Если гидроксилирование пролина необходимо для формирования тройной спирали, то гидроксилирование лизина нужно для образования ковалентных поперечных сшивок между цепями, которое происходит вне клетки. Остатки Hyl, кроме того, служат центрами присоединения Сахаров. Недостаток лизилгидроксилазы в организме приводит к нарушениям в структуре соединительных тканей, при которых наблюдаются аномальные механические свойства кожи и связок (синдром Элерса – Данлоса). В ходе развития организма уровень лизилгидроксилазы понижается [7]. Таким образом, она также может быть ключевым фактором в регуляции биосинтеза коллагена и в формировании его структуры.

Гликозилирование проколлагена

Гликозилирование проколлагена – это посттрансляционная модификация про-α-цепей, которая представляет собой ферментативный процесс, протекающий внутриклеточно в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме до того, как тройная спираль проколлагена выйдет из клетки. В молекуле коллагена есть галактозилоксилизиновые и глюкозилгалактозилоксилизиновые остатки. Галактозиловая группа связана 0-гликозидной связью с гидроксильной группой Hyl (0-β-D-галактопиранозилоксилизин). Вблизи центра гликозилирования наблюдается характерная последовательность аминокислот: Gly – X – Hyl – Arg [49]. Считают, что эта область может быть носителем главной антигенной детерминанты коллагена. Вносит ли гликозилирование свой вклад в образование сшивок между цепями и (или) в соединение мономеров при формировании фибрилл коллагена, неизвестно.

В реакции гликозилирования принимают участие ферменты галактозилтрансфераза и глюкозилтрансфераза. Они переносят галактозиловый и глюкозиловый остатки UDPгликозида на оксилизин и галактозилоксилизин про-α-цепей в цистернах шероховатого эндоплазматического ретикулума. Кофактором для того и другого фермента служит Mn²⁺. Глюкозилтрансфераза представляет собой одиночную цепь с мол. массой 70000. Этот фермент высоко специфичен и катализирует только перенос глюкозы на галактозиловый остаток про-α-цепи [1, 2]. Субстратом для обоих ферментов является только одиночная про-α-цепь. Ни тройная спираль мономера проколлагена, ни свободный Hyl не гликозилируются. Кроме того, эта реакция протекает при специфической последовательности аминокислот в цепи Gly – X – Hyl, если X не является Pro или Hyp. Это указывает на то, что гликозилирование происходит до того, как про-α-цепи агрегируют. Следовательно, скорость формирования тройной спирали может определяться скоростью гликозилирования. In vitro гликозилирующий фермент из клеток сухожилия куриного эмбриона ингибируется кортизолацетатом [55].

Таблица 4.2. Процессы биосинтеза коллагена

Все четыре фермента, необходимые для внутриклеточной модификации про-α-цепей: пролил– и лизилгидроксилазы и галактозил– и глюкозилтрансферазы, у куриных эмбрионов имеют наибольшую активность в возрасте 14–16 сут [66]. Степень гидроксилирования лизиновых остатков в коллагене типов I и III мала, и, следовательно, в тканях, которые содержат этот коллаген, низок уровень галактозил– и глюкозилтрансферазы. В коллагене типов II и IV, который имеется в связках и в базальных мембранах соответственно, гидроксилирование лизина протекает активно, и уровень гликозилтрансфераз здесь также высок. Степень гликозилирования в коллагене разных тканей различна.

Секреция проколлагена

Тройная спираль проколлагена выделяется в межклеточный матрикс. В клетках фибробластов в культуре in vitro при ингибировании образования микротрубочек уменьшается выход проколлагена, а также его превращение в коллаген. Выход проколлагена из фибробластов уменьшается и при ингибировании гидроксилирования пролиновых остатков путем связывания Fe2+ в хелаты или путем инкубации клеток в анаэробных условиях. Добавление в среду инкубации аналогов пролина и лизина приводит к тому же результату. Считают, что скорость синтеза коллагена регулируется гидроксилированием пролиновых остатков, внутриклеточным пулом пролина и уровнем пролилгидроксилазы. Существует также несколько других контрольных пунктов – это трансляция на полисомах, агрегация цепей и их секреция. Нарушение процессов в любом из этих пунктов может замедлить синтез коллагена. Схема его синтеза выглядит следующим образом:

Внеклеточные процессы

Частичный протеолиз

Тройная спираль проколлагена после выхода в межклеточный матрикс подвергается частичному протеолизу и превращается в полностью сформированный мономер коллагена [85]. Две разные проколлагенпептидазы, обе внеклеточные, одна – специфическая для NH₂-концевого пропептида, другая – для COOH-концевого пропептида, отщепляют от NH₂– и COOH-концов соответственно неспиральные пропептиды [41, 51, 54]. Первым отщепляется NH₂-пропептид, затем COOH-пропептид [13]. Пептидазы не являются сериновыми ферментами и не ингибируются SH-реагентами [25]. NH₂-пептидазу выделили в чистом виде из кожи, сухожилия и связок крыс и костей кур. Она активна при нейтральном рН и не ингибируется n-хлормеркурибензоатом (nХМБ). Одиночные про-α-цепи также служат субстратом для этого фермента. Он расщепляет пептидные связи между X – Glu и X – Gin. Затем Glu и Gin на NH₂-конце циклизуются в остатки пирролидонкарбоновой кислоты. Каждая полностью сформированная цепь в результате содержит ~1012 остатков и имеет мол. массу 95000. Девяносто пять процентов каждой цепи имеют в каждом третьем положении, за исключением небольших участков на NH₂– и COOH-концах, глициновый остаток. Об изменениях проколлагенпептидазы с возрастом имеющиеся сведения скудны. Известно, лишь, что при наследственной болезни крупного рогатого скота – дерматозпараксизе (неэластичная кожа, слабые суставные связки), для которой характерна невыраженная бороздчатость коллагена, уровень фермента очень низок.

Модификация оксилизиновых остатков и образование поперечных сшивок

Гидронсилиорование пролиновых и лизиновых остатков происходит в клетке. Оксилизиновые остатки в α-цепях подвергаются дальнейшей химической модификации в межклеточном матриксе. Эти процессы играют важную роль в образовании ковалентных поперечных сшивок полипептидных цепей и формировании коллагеновых фибрилл. Известно, что при нарушениях в ходе модификаций меняется структура, а следовательно, и функции коллагена. О возрастных изменениях в реакциях модификации оксилизиновых остатков известно мало, имеется лишь некоторая информация о нарушениях при ряде заболеваний. При синдроме Элерса – Данлоса, для которого характерны потеря эластичности кожи и связочного аппарата с повторными вывихами суставов, обнаружено заметное уменьшение числа оксилизиновых остатков [59]. Коллаген кожи становится аномально растворимым в денатурирующих агентах, а количество лизилгидроксилазы значительно уменьшается то сравнению с нормой. Возможно, это связано с неправильным образованием поперечных сшивок, когда многие из оксилизиновых остатков становятся недоступными.

В коллагене обнаружены три основных типа поперечных сшивок [74, 76, 77, 79]. Они образуются после ферментативной модификации лизиновых остатков в альдегидную форму, аллизин, вне клетки с помощью фермента лизилоксидазы. Аллизин играет важную роль в возникновении сшивок. Поперечные сшивки можно идентифицировать путем их восстановления боргидридом натрия (NaBH₄). Если использовать меченый тритием NaB³H₄, тритий включается в поперечные сшивки, которые затем и определяют. Подобные исследования показали, что сшивки представляют собой альдимин (шиффово основание). Структура некоторых из них приведена ниже.

Схема 4.1

Лизилоксидаза – внеклеточный фермент, содержащийся в костях и других тканях, катализирует удаление NH₂-групп лизиновых и оксилизиновых остатков в неспиральных NH₂– и COOH-концевых участках и одновременно окисляет ε-углерод в CHO. При этом образуются δ-полуальдегид α-аминоадипиновой кислоты (аллизин) и δ-толуальдегид δ-окси-α-аминоадипи-новой кислоты соответственно. Поперечные сшивки образуют только δ-полуальдегид α-аминоадипиновой кислоты и δ-полуальдегид δ-окси-α-аминоадипиновой кислоты [77]. Фермент специфически дезаминирует лизиновые остатки полипептидной цепи, но не активен по отношению к свободному лизину. Он ингибируется β-аминопропионитрилом. В культуре клеток фибробластов in vitro поперечные сшивки в мономерах коллагена не возникают, если в среду добавлен β-аминопропионитрил или в ней недостаточно меди. Описанный дефект аналогичен наблюдаемому при латиризме.

Альдегидные группы легко вводятся в Lys₉ α₁-цепи и в Lys₆ α₂-цепи l[83]. Lys₁₀₄₄ в COOH-концевом участке (девятый от COOH-конца) также превращается в аллизин [65]. В COOH-концевом участке есть и оксилизиновые остатки, которые тоже вносят вклад в образование поперечных сшивок. Некоторые из наиболее типичных поперечных сшивок изображены на схеме 4.2.

Схема 4.2

Поперечные сшивки коллагена различны в разных тканях и в α-цепях разных типов [3]. Например, в связках, в которых проколлаген образуется только из α1(II) – цепей, поперечные сшивки представляют собой в основном дегидродиоксилизинонорлейцин (ДДОЛНЛ). Такие же сшивки есть в коллагене матки, состоящем из α1– и α2-цепей. Из цепей этих двух типов более предпочтительно сшиваются α2-цепи. Поэтому при фракционировании коллагена из таких тканей получают в основном димеры α2 и мономеры α1. Кроме того, оказалось, что природа поперечных сшивок зависит от степени гидроксилирования лизиновых остатков в NH₂-концевом тело пептиде. В тканях типа костей и связок, в которых содержится наименее растворимый коллаген, образуется ДДОЛНЛ. В коллагене сухожилий, кожи и других тканей кроме ДДОЛНЛ имеются другие, более лабильные сшивки типа дегидроксинорлейцина (ДОНЛ), В образование межмолекулярных связей включается и фракция С, но в коллагене костей, связок и матки она практически отсутствует. Обнаружено, что в матке, коже и других мягких тканях она имеет в основном специальные функции.

Предложена модель превращения проколлагена в коллаген [14]. Цистеиновые остатки на COOH-конце про-α-цепи образуют S – S-связи, что способствует выстраиванию цепей в тройную спираль проколлагена в клетке. После секреции во внеклеточное пространство NH₂-концевая протеаза удаляет NH₂-концевые пропептиды. Затем с помощью COOH-концевой протеазы удаляются COOH-концевые пропептиды, при этом исчезают и участки, связанные S – S-связями, и образуется молекула коллагена. В коллагене нет COOH-концевых участков, связанных S – S-связями.