Текст книги "Биохимия старения"
Автор книги: Роберт Сапольски
сообщить о нарушении
Текущая страница: 5 (всего у книги 19 страниц)
ADPрибозилирование
Есть сообщения, что поли-ADPрибоза ковалентно связывается с ядерными белками [269, 279]. Было показано, что эта реакция катализируется поли-ADPрибозополимеразой, ассоциированной с хроматином [334]. Молекула фермента из тимуса быка состоит из одной полипептидной цепи с мол. массой 130000; этот фермент полностью активен только в присутствии ДНК [380]. Он связан с межнуклеосомной областью хроматина и, по-видимому, способствует образованию структур хроматина высшего порядка [55]. Субстратом в этой реакции служит NAD+ [56]. Фермент ингибируется никотинамидом, тимидином, цитокининами и метилксантином [226]. В основном ADPрибозилированию как in vivo, так и in vitro подвергается гистон Н1 и до некоторой степени гистон Н2В. Другие нуклеосомные гистоны в печени крыс модифицируются чрезвычайно слабо (если вообще модифицируются) [277, 356]. Центр ADPрибозилирования в гистоне Н1 все еще окончательно не идентифицирован. Было высказано предположение, что он присоединен эфирной связью к глутамату [106]. С помощью фермента в гистон последовательно внедряется от двух до одиннадцати молекул ADPрибозы. Сообщалось о наличии в ядрах клеток из печени крысы разветвленных цепей ADPрибозы, состоящих из 65 остатков [339]. Модификация, по-видимому, происходит следующим образом:
Фосфорилирование серина препятствует ADPрибозилированию [69]. Серии также может быть ADPрибозилирован [277]. Гистон Н6 (белок HMG спермы форели), протамины и некоторые компоненты НГБ также ADPрибозилируются [271, 374, 381]. Связь с ADPрибозой неустойчива в щелочной среде [155]. Поли-(ADPрибозо)гликогидролаза отщепляет полимер от гистона [254]. ADPрибозилированные гистоны легче отделяются от хроматина, чем другие модифицированные гистоны. По-видимому, после ADPрибозилирования связь гистонов с ДНК ослабевает. Это происходит из-за увеличения отрицательных зарядов гистонов и, кроме того, из-за большого размера молекулы, которая способна деформировать структуру хроматина [286]. Функция полимеров ADPрибозы, ковалентно присоединяющихся не только к гистонам, но и к НГБ, еще не установлена. Предполагается, что они участвуют в синтезе и репарации ДНК, в образовании структуры хромосом и в дифференцировке клеток. Содержание ADPрибозополимеразы увеличивается в 3–4 раза в G1-фазе и в процессе дифференцировки эритролейкозных клеток мышей [298]. В клетках HeLa наиболее интенсивное поли-ADPрибозилирование наблюдается в фазе G1, а самое слабое – в фазе S. В результате ADPрибозилирования ядерных белков может происходить их отделение от ДНК, что содействует ее репликации в S-фазе. Таким образом, рассматриваемая модификация может быть необходимой для репликации ДНК. Это подтверждается тем фактом, что синтез ДНК в ядрах, выделенных из печени куриного эмбриона, после ADPрибозилирования увеличивается [341].
Полиамины – спермин, спермидин и путресцин – стимулируют ADPрибозилирование ядерных белков в упомянутом порядке. Стимулирующим эффектом обладает также Mn2+ [340]. ADPрибозилирование гистонов Н1 в клетках HeLa увеличивается в присутствии полиаминов почти в 3 раза [61]. Спермин стимулирует ADPрибозилирование НГБ клеток в культуре, а Mn2+ стимулирует ADPрибозилирование гистонов. Если в инкубационной среде присутствуют и спермин, и Mn2+, то НГБ модифицируются в большей степени, чем гистоны. Таким образом, полиамины и ионы металлов оказывают, по-видимому, регулирующее действие на ADPрибозилирование ядерных белков.
Подводя итоги, можно сказать, что ковалентные модификации хромосомных белков, в частности гистонов, могут оказывать значительное влияние на структуру и функции хроматина. Основные характеристики модифицирующих реакций показаны на рис. 2.4 и заключаются в следующем. 1) Фосфорилирование и ADPрибозилирование происходят в основном в гистоне Н1, а ацетилирование и метилирование – в нуклеосомных гистонах. 2) Фосфорилирование, ADPрибозилирование и ацетилирование приводят к уменьшению общего положительного заряда гистонов и к отделению их от ДНК, тогда как метилирование ведет к увеличению положительного заряда, что делает связь с ДНК более сильной. 3) Гистоны могут претерпевать все эти изменения одновременно, что приводит к значительным изменениям их ионной структуры. 4) Фосфорилирование, очевидно, представляет собой общее явление: оно менее специфично по сравнению с другими модификациями и происходит в делящихся клетках в течение всего клеточного цикла. По-видимому, фосфорилирование необходимо для репликации ДНК и деления клеток. Три другие модификации, вероятно, более специфичны. Ацетилирование происходит главным образом в метаболически активных клетках и, по-видимому, включено в процесс транскрипции. Метилирование, будучи необратимым процессом, может быть важным для репрессии активности генов и для дифференцировки. 5) Все эти модификации специфически модулируются специальными эндогенными эффекторами, в том числе гормонами. Специфические и дифференциальные модификации хромосомных белков могут происходить в разные периоды жизни и приводить к избирательной экспрессии генов.
В то время как накоплено значительное количество данных о ковалентных модификациях гистонов, о подобных модификациях НГБ известно относительно мало. Скудна также информация о скоростях и последовательности дефосфорилирования, деацетилирования и де-ADPрибозилирования.
Модуляция модификаций хромосомных белков
Описанные выше реакции хромосомных белков катализируются специфическими ферментами. Поэтому факторы, изменяющие содержание, и активность этих ферментов, могут также изменять степень этих модификаций и, следовательно, структуру и функции хроматина. Кроме того, скорость и глубина модификаций, особенно тех, которые, подобно фосфорилированию и ацетилированию, характеризуются высокой обратимостью, могут регулироваться фосфатазами и деацетилазами соответственно. Содержание и активность этих ферментов в свою очередь контролируются набором других эффекторов.
Фосфорилирование хромосомных белков осуществляется протеинкиназами, которые обычно активируются сАМР. По-видимому, эти протеинкиназы имеют различную специфичность не только по отношению к гистонам и НГБ, но и по отношению к различным центрам гистонов. Протеинкиназы активируются сАМР, который синтезируется с помощью аденилатциклазы. Содержание сАМР зависит от фосфодиэстеразы (рис. 5.2). Таким образом, изменения в содержании и активности одного или нескольких ферментов влияют на скорость и уровень фосфорилирования [137]. Кроме того, уровень фосфорилирования регулируется также содержанием фосфатаз. Свойственна ли фосфатазам специфичность, как протеинкиназам, неизвестно.
Фосфорилирование хромосомных белков катализируется специфическими протеинкиназами, которые стимулируются сАМР in vitro [213] и in vivo [214]. сАМР-зависимая протеинкиназа из молочной железы коровы фосфорилирует гистоны, богатые лизином, но неактивна в отношении гистонов, богатых аргинином [28]. Кальций ингибирует аденилатциклазу, и поэтому в его присутствии содержание сАМР уменьшается [38]. Вместе с тем он стимулирует гуанилатциклазу и увеличивает содержание cGMP [132]. Поэтому изменение содержания кальция может приводить к изменению содержания циклических нуклеотидов, что в свою очередь может оказывать влияние на активность протеинкиназ и, следовательно, на степень фосфорилирования белков [204]. Содержание кальция в крови и тканях в различных физиологических условиях различно, причем оно изменяется с возрастом [246]. От него зависит фосфорилирование хромосомных белков. В экспериментах in vitro показано, что кальций ингибирует фосфорилирование гистонов из полушарий большого мозга и стимулирует фосфорилирование НГБ [182]. Кальций, будучи катионом, способен вытеснять гистоны из хроматина, взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК [76] и, таким образом, изменять ее матричную активность. Как одновалентные, так и двухвалентные катионы (Na+, K+ и Mg2+) ингибируют фосфорилирование гистонов [256], причем ингибирование Mg2+ следует из того, что он связывается с АТР. Было показано, что Zn2+ способствует образованию аномально высокого количества фосфорилированного гистона Н1, ингибируя активность Н1-гистон-фосфатазы [324].
На фосфорилирование хромосомных белков влияют некоторые стероиды [234]; гидрокортизон, например, стимулирует их фосфорилирование [364], причем он усиливает фосфорилирование гистонов, богатых как лизиновыми, так и аргининовыми остатками [264]. Дексаметазон стимулирует фосфорилирование гистонов Н1 и Н2А клеток HeLa в G1– и S-фазах. Стимулирующий эффект в большей степени проявляется у гистона Н2А [292]. Гидрокортизон повышает степень фосфорилирования НГБ в дискретных хромосомных локусах, вслед за чем увеличивается синтез РНК [314]. Эстрадиол стимулирует синтез специфических НГБ в матке [346]. Это подтверждается экспериментами [88], в которых обнаружено, что увеличение фосфорилирования НГБ происходит, по крайней мере частично, в результате повышения активности ядерной протеинкиназы.
Под действием пептидных гормонов увеличивается содержание сАМР, и поэтому стимулируется фосфорилирование Ser-37 гистона Н1 [43, 215]. В результате такого специфического фосфорилирования гистона Н1 усиливается транскрипция хроматина из тимуса теленка [121]. Тиротропин также стимулирует фосфорилирование гистона Н1 [212].
Полиамины – спермин и спермидин, принимающие участие в делении и росте клеток, стимулируют фосфорилирование НГБ [171]. Когда с помощью фитогемагглютинина стимулировали деление лимфоцитов, на начальных стадиях происходило фосфорилирование НГБ [192].
Установлено, что гистон Н1 из печени плода фосфорилирован в большей степени, чем у взрослой особи [22]. Клетки печени плода делятся быстрее, чем клетки взрослой особи. Таким образом, имеется, по-видимому, корреляция между фосфорилированием гистона Н1 и делением клеток. Эти результаты подтверждаются тем фактом, что в регенерирующей печени гистон Н1 фосфорилируется в большей степени, чем другие гистоны [317].
Ацетилирование хромосомных белков также модулируется некоторыми факторами. Гидрокортизон стимулирует ацетилирование гистонов и одновременно усиливает синтез РНК [9, 10]. Таким образом, имеется хорошая корреляция между ацетилированием гистонов и активностью генов. Есть данные о том, что эстрадиол усиливает ацетилирование богатых аргинином гистонов из матки крыс [228], а также стимулирует синтез РНК [152]. Так как известно, что эстрадиол стимулирует транскрипцию в некоторых тканях, а ацетилирование гистонов, возможно, необходимо для транскрипции, было изучено влияние эстрадиола на ацетилирование гистонов из срезов головного мозга in vitro [349]. Было показано, что эстрадиол стимулирует ацетилирование как гистонов, так и НГБ, причем особенно сильно он стимулирует ацетилирование гистона Н4.
Гормоны, действие которых реализуется с помощью сАМР, также стимулируют ацетилирование гистонов. Эритропоэтин стимулирует ацетилирование гистонов и синтез РНК в клетках селезенки у мышей с полицитемией [338]. Адреналин также стимулирует ацетилирование гистонов, причем только гистонов Н3 и Н4 [349]. Двухвалентные катионы ингибируют активность гистон-ацетилтрансферазы и, следовательно, ацетилирование гистонов [33, 237]. Этот результат вызывает недоумение, так как хорошо известно, что двухвалентные катионы необходимы для активности ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Есть данные, что цистеин сильно ингибирует ацетилирование гистонов [33]. ЛСД (диэтиламид лизергиновой кислоты) усиливает ацетилирование гистонов из мозга крыс [52].
Показано, что бутират – промежуточный продукт метаболизма жирных кислот – вызывает гиперацетилирование гистонов, причем он специфичен в отношении гистонов Н3 и Н4 [302]. Это осуществляется путем ингибирования гистон-деацетилазы [41, 68], так что если ацетатная группа введена в гистон, то она уже не удаляется. При этом, по-видимому, происходят конформационные изменения в нуклеосомах и увеличивается восприимчивость ДНК к ДНКазе I. Отсюда следует, что стимулирование транскрипции, наблюдающееся после ацетилирования, может объясняться такими конформационными изменениями в нуклеосомах, благодаря которым РНК-полимераза более эффективно связывается с ДНК. Показано также, что с увеличением ацетилирования гистонов Н3 и Н4 синтез ДНК подавляется [146]. Таким образом, ацетилирование гистонов, по-видимому, необходимо для транскрипции, но не для репликации.
Очень мало известно о модуляции метилирования хромосомных белков. Метилирование – процесс стабильный. Так как оно происходит главным образом в гистонах Н3 и Н4 и метильные группы не вступают в дальнейшие превращения, метилирование может играть роль в репрессии специфических генов, которая происходит на стадии дифференцировки. Было бы интересно выяснить, стимулируется ли при деметилировании гистонов активность специфических областей генома.
Есть сообщение, что кортизон усиливает метилирование НГБ в специфических хромосомных локусах [314], тогда как эстрадиол не влияет на метилирование гистонов [348]. Чрезвычайно важно, однако, что эстрадиол сильно ингибирует метилирование ДНК. Цитозин ДНК метилируется с образованием 5-метилцитозина. Такое метилирование может вызвать более сильное связывание ДНК с белками. Следовательно, ингибирование метилирования ДНК эстрадиолом может вызывать отделение ДНК от этих белков и усиливать транскрипцию. Изменения в структуре и функциях хроматина, вызываемые метилированием, требуют дальнейших исследований.
ADPрибозилирование гистонов представляет собой модификацию, в результате которой не только вводятся отрицательные заряды, но может также деформироваться комплекс хроматина. О возможности модуляции этой модификации известно мало. Поскольку это необратимый процесс, как и метилирование, он может быть необходим для дифференцировки и перевода клетки в постмитотическое состояние. Изучение этой модуляции поможет пролить свет на механизм дифференцировки и экспрессии генов.
Возрастные изменения в структуре и функциях хроматина
Схема потока информации у эукариот выглядит следующим образом: ДНК→РНК→Белок. Скорость образования и количество различных белков, необходимых для осуществления специфических функций, может регулироваться на одном или на нескольких этапах: а) транскрипция гетерогенных ядерных РНК(гяРНК) – предшественников на хроматине; б) процессинг гяРНК-предшественников до зрелых мРНК, способных к трансляции; в) трансляция мРНК на рибосомах и г) разрушение белков различными факторами. Кроме того, количество активных и неактивных белков, способных к активированию, может регулироваться путем непосредственной модуляции активности белков, например их фосфорилированием и аденилированием. Транскрипция, которая является первым и главным этапом в приведенной выше последовательности событий, может модулироваться с помощью изменений в структурной организации хроматина. Эти изменения, по-видимому, могут касаться: а) образования нужной конформации ДНК, б) доступности ДНК для ДНК-полимеразы, в) степени ассоциации гистонов и НГБ с ДНК, г) модификаций гистонов и НГБ, изменяющих их ассоциацию с ДНК.
Изменения транскрипции и, следовательно, активности хроматина происходят во время дифференцировки. Когда активно делящиеся миобластные клетки сливаются, чтобы образовать многоядерную неделящуюся клетку мышцы, изменяется структура синтезируемой РНК и уменьшается ее общее количество [377], а образование рибосомной РНК (рРНК) сильно падает [87]. Это подтверждается тем фактом, что количество РНК, гибридизованной с ДНК после слияния клеток, значительно меньше, чем в делящихся клетках. Процентное содержание РНК с уникальными последовательностями оснований после слияния выше. Это указывает на то, что в дифференцированных клетках экспрессия специфических генов выше, чем других генов, в отличие от делящихся, недифференцированных клеток. Таким образом, во время и после дифференцировки происходят как качественные, так и количественные изменения активности хроматина. По-видимому, имеются контролирующие механизмы, воздействующие как на уникальные, так и на повторяющиеся последовательности ДНК. Клетки сердечной мышцы после рождения перестают делиться, и это сопровождается уменьшением транскрипции. Их ДНК становится менее восприимчивой к ДНКазе I, и температура ее плавления повышается [231].
Описанным выше наблюдениям не противоречат данные, согласно которым слияние миобластов сопровождается сильным увеличением активности креатинфосфокиназы (КФК), что указывает на более интенсивную транскрипцию ее мРНК [257, 259, 317а]. Показано, что активность КФК у цыпленка увеличивается в период дифференцировки в 20 раз, и причиной этому служит увеличение количества ММ-изофермента. Отсюда следует, что транскрибируется преимущественно ген М-субъединицы [235]. Другим важным изменением, происходящим во время дифференцировки сердечной мышцы, является полное прекращение синтеза ДНК-полимеразы [86].
Подобные изменения в транскрипционной активности хроматина происходят на стадии эмбриогенеза у амфибий [102] и морских ежей [118]. Качественные изменения наблюдаются и при индуцированной гормонами дифференцировке молочной железы [355]. Механизм, с помощью которого осуществляется дифференциальная экспрессия генов, неизвестен. Вопрос заключается в том, возникают ли изменения в хроматине – структурные и функциональные – после достижения зрелости и ведут ли эти изменения к старению организма. Для того чтобы найти ответ на эти вопросы, многие исследователи изучали разные свойства хроматина в зависимости от возраста.
В ряде работ измеряли температуру плавления (Tm) хроматина из печени и тимуса, и во всех случаях было обнаружено в старческом возрасте увеличение Tm [31,32, 149,208, 274, 296]. С помощью ЭВМ был изучен профиль температуры плавления хроматина; было обнаружено, что гиперхромизм и Tm в старости увеличиваются [297]. Это может объясняться увеличением с возрастом числа ковалентных связей между хромосомными белками и ДНК [147–150]. Данная точка зрения согласуется с тем, что количество белка, которое можно экстрагировать из хроматина с помощью солевого раствора, с возрастом уменьшается [274], а количество одноцепочечных разрывов в ДНК увеличивается [80], так как включение 3Н-тимидина в ДНК с возрастом увеличивается [143, 294, 311]. Показано, что ДНК печени старой мыши (20 мес) более чувствительна к S1-нуклеазе, чем ДНК мыши в возрасте от 1 до 15 мес [81]. При седиментации ДНК из мозга мыши в градиенте щелочной сахарозы образуются четыре полосы для старых животных и одна для молодых, что свидетельствует о деградации ДНК в старческом возрасте в результате одноцепочечных разрывов. Такие разрывы в ДНК могут обеспечивать центры для ее ковалентного связывания с хромосомными белками. Одним из факторов, который, по-видимому, способствует образованию разрывов, является диметилирование цитозина. Сообщается, что небольшая доля (3– 10 %) цитозина ДНК постсинтетически метилируется с образованием 5-метилцитозина [54, 322]. Эта модификация предохраняет данный сайт ДНК от расщепления ферментом рестрикции [37, 128, 304], в частности ферментом Нра II [240, 323]. В результате деметилирования цитозинов эти сайты могут стать восприимчивыми к расщеплению, что приведет к увеличению числа разрывов в ДНК. Известно, что содержание 5-метилцитозина в печени рыб с возрастом уменьшается [358]. Однако показано, что метилирование ДНК, выделенной из полушарий головного мозга крыс, в старости увеличивается [348]. Это может усиливать связь ДНК с гистонами и не только увеличивать Tm хроматина, но и уменьшать его матричную активность. Стабильны ли метильные группы ДНК – неизвестно, но весьма вероятно, что метилирование ДНК осуществляется ферментами, отличными от тех, которые метилируют гистоны.
Изучение гибридизации ДНК – РНК в печени мышей показало, что доля ДНК, которая гибридизуется с уникальными и повторяющимися последовательностями РНК, с возрастом уменьшается [92]. Как отсюда следует, с возрастом уменьшается доля транскрибируемой ДНК, что в свою очередь указывает на увеличение связывания и маскировки ДНК хромосомными белками. С помощью того же метода измерялось число транскрибированных рибосомных генов на гаплоидный геном мыши [126, 127]. В возрасте более 2 лет наблюдалось резкое уменьшение числа транскрибированных генов. Однако у человека подобные изменения не обнаруживаются. Аналогичные методы использовались для количественной оценки процентного содержания транскрибированной сателлитной ДНК в различных тканях мыши [291]. В селезенке, почках и в мозгу изменений не наблюдалось, но в печени с возрастом ее количество увеличивалось.
Несколько исследователей изучали транскрипцию РНК на хроматине в зависимости от возраста. В экспериментах in vitro с использованием срезов печени и мозга было показано, что синтез РНК в этих тканях в старческом возрасте уменьшается [103, 145]. Причиной этого может являться уменьшение количества РНК-полимеразы [51, 239]. Обнаружено, что транскрипционная активность различных тканей в старости уменьшается [274, 296]. Результаты, полученные в опытах in vivo, свидетельствуют о том, что синтез РНК в печени, мозгу, сердце и селезенке крыс в старческом возрасте понижается [181]. С возрастом претерпевают качественные изменения типы синтезируемых РНК, а отношение РНК: белок уменьшается [92]. РНК некоторых типов, синтезируемые в организме в среднем возрасте, в старости исчезают, и появляются молекулы новых типов, которые не синтезируются в репродуктивном периоде. Это напоминает возрастные изменения в наборе изоферментов, например аланинаминотрансферазы и лактатдегидрогеназы (гл. 3).
Содержание гистонов в клетке каждой ткани остается приблизительно постоянным на протяжении всей жизни [71]. В нуклеосомных гистонах печени и селезенки крыс и мышей количественных и качественных изменений не происходит, но изменяются три субфракции гистона Н1 [248, 249]. Так, в старческом возрасте специфически увеличивается количество субфракции гистона Н1, содержащей метионин. Предстоит выяснить, как это влияет на структуру и функции хроматина. Сообщается, что содержание НГБ и РНК в хроматине крыс с возрастом уменьшается [104, 207].
Хотя гистонов всего несколько и они играют структурную роль, изменения в степени их ассоциации с ДНК могут иметь значение как при транскрипции, так и при репликации. Благодаря различным ковалентным модификациям их ассоциация с ДНК может меняться. Канунго и его сотрудники исследовали in vitro зависимость ковалентных модификаций гистонов от возраста и модуляции этих модификаций различными эндогенными факторами. В опытах использовали срезы коры головного мозга крыс разного возраста. Схема этих исследований показала на рис. 2.5. Было обнаружено, что фосфорилирование гистонов полушарий большого мозга с возрастом уменьшается [182]. В частности, резко уменьшается фосфорилирование гистонов Н1 и Н4. Кальций ингибирует фосфорилирование гистонов, особенно гистонов Н1 и Н4. Этот эффект в старческом возрасте уменьшается (рис. 2.6). Эстрадиол стимулирует фосфорилирование гистонов [183], особенно у взрослых животных, но этот эффект в старости исчезает (рис. 2.7). При уменьшении фосфорилирования гистонов может усиливаться их связь с ДНК благодаря уменьшению числа отрицательных зарядов.
Рис. 2.5. Схема проведения in vitro ковалентных модификаций хромосомных белков и модуляции матричной активности хроматина в срезах коры головного мозга крыс
Рис. 2.6. Влияние кальция на включение 32P в гистоны коры головного мозга крыс-самок разного возраста [182].
А. Норма. Б. Добавлен Са2+
Рис. 2.7. Влияние эстрадиола на включение 32P в гистоны коры головного мозга крыс-самок разного возраста [183].
А. Норма. Б. Добавлен эстрадиол
Ацетилирование гистонов играет роль в транскрипционной активности хроматина. Показано, что ацетилирование гистонов из мозга крыс с возрастом уменьшается [349]. При этом специфическое уменьшение наблюдается для гистонов Н3 и Н4, а ацетилирование гистона Н1 не меняется. Адреналин стимулирует ацетилирование гистона Н1, а эстрадиол – гистона Н3. Эти модулирующие эффекты в старческом возрасте уменьшаются. Кальций не оказывает значительного влияния на ацетилирование гистонов (рис. 2.8).
Рис. 2.8. Влияние кальция и эстрадиола на ацетилирование отдельных гистонов коры головного мозга крыс-самок разного возраста [348, 349].
А. Норма. Б. Добавлен Са2+. В. Добавлен эстрадиол
Было изучено влияние ацетилирования гистонов и его модуляций, вызываемых бутиратом и эстрадиолом, на функции хроматина из коры головного мозга крыс [184]. Как бутират, так и эстрадиол, добавленные в инкубационную среду, содержащую 14С-ацетат и срезы головного мозга, стимулировали ацетилирование гистонов у молодых крыс. Этот эффект сильно уменьшался у взрослых особей и вообще не наблюдался у старых животных (110 нед). Если из этих срезов выделяли ядра и использовали их для транскрипции при инкубировании с 3H-UTP и другими нуклеотидтрифосфатами, то наибольшее стимулирование транскрипции наблюдалось у молодых крыс, а у взрослых этот эффект сильно уменьшался. Изучаемые модуляторы ее оказывают никакого влияния на транскрипцию у старых крыс (рис. 2.9). Полученные данные указывают не только на корреляцию между ацетилированием гистонов и транскрипцией хроматина, но и на уменьшение в старческом возрасте модулирующего влияния бутирата и эстрадиола. Это может быть обусловлено структурными и конформационными изменениями хроматина, появляющимися при увеличении возраста.
Рис. 2.9. Включение 3H-UMP в РНК из ацетилированных ядер коры головного мозга крыс-самок разного возраста и действие масляной кислоты и эстрадиола [184].
1 – срез; 2 – срез после ацетилирования; 3 – срез после ацетилирования + масляная кислота; 4 – срез после ацетилирования + эстрадиол
Изучение метилирования гистонов из мозга крыс показало, что эта модификация с возрастом также замедляется, особенно в случае гистонов Н3 и Н4 (рис. 2.10) [348]. Однако метилирование является стабильной модификацией, и поэтому несмотря на то, что с возрастом происходит замедление включения групп 14СН3, общее число метальных групп в гистонах увеличивается, так как те группы, которые были введены в более раннем возрасте, уже не удаляются. При метилировании гистонов, особенно при образовании триметиллизиновых остатков гистона Н3, их связь с ДНК усиливается. Эстрадиол стимулирует метилирование гистона Н2В, а кальций – гистона Н3. Эти модуляционные эффекты в старческом возрасте отсутствуют. Ковалентные модификации определенных гистонов специфическими эффекторами, несомненно, меняют не только структуру, но и функции хроматина.
Рис. 2.10. Влияние кальция и эстрадиола на метилирование отдельных гистонов коры головного мозга крыс-самок разного возраста [348].
А. Норма. Б. Добавлен Са2+. В. Добавлен эстрадиол
Содержание НГБ с возрастом уменьшается [208, 384]. Метаболически активные ткани содержат больше этих белков, чем неактивные. По-видимому, с уменьшением их количества активность тканей снижается. Электрофорезом НГБ мозга в полиакриламидном геле были показаны не только качественные, но и количественные возрастные изменения во фракциях НГБ [185]. Ковалентные модификации НГБ и их модуляция различными эндогенными эффекторами также зависят от возраста [182, 183, 185, 349]. Показано, что фосфорилирование, ацетилирование и метилирование НГБ мозга в старости очень сильно замедляются. Кальций стимулирует их фосфорилирование как в среднем, так и в старческом возрасте. Однако стимулирующий эффект эстрадиола, наблюдающийся в среднем возрасте, в старости не проявляется (рис. 2.11, 2.12). Кальций не стимулирует ацетилирование НГБ, а эстрадиол и адреналин стимулируют его у молодых крыс, но не оказывают влияния в случае крыс среднего возраста и старых крыс (рис. 2.13). Ни кальций, ни эстрадиол не влияют на метилирование НГБ. Показано, что эти эффекторы модулируют модификацию специфических НГБ [185]. Вероятно, фосфорилирование НГБ более важно для экспрессии генов, чем их ацетилирование и метилирование. Как позволяют предположить эти данные, замедление ковалентных модификаций НГБ в старческом возрасте может происходить из-за того, что соответствующие центры становятся малодоступными. Это в свою очередь может быть обусловлена конформационными изменениями в хроматине вследствие более сильного связывания НГБ с ДНК.
Рис. 2.11. Влияние кальция на фосфорилирование отдельных НГБ коры головного мозга крыс-самок разного возраста [185].
А. Норма. Б. Добавлен Са2+
Рис. 2.12. Влияние эстрадиола на фосфорилирование отдельных НГБ белков коры головного мозга крыс-самок разного возраста [185].
А. Норма. Б. Добавлен эстрадиол
Рис. 2.13. Влияние кальция и эстрадиола на ацетилирование отдельных НГБ коры головного мозга крыс-самок разного возраста [185].
А. Норма. Б. Добавлен Са2+. В. Добавлен эстрадиол
Функции хроматина самым тесным образом связаны с его структурной организацией, и если структура меняется, то, несомненно, меняются и функции. К функциям хроматина относятся репликация и транскрипция. Показано, что у свободноживущей нематоды Turbatrix aceti, клетки которой не делятся, активность ДНК-полимеразы с возрастом уменьшается [45].
Есть сообщение, что синтез ДНК в постмитотических тканях – в мозгу, сердце и печени – у старых крыс усиливается [294]. Клетки этих тканей не вступают в митоз. Поэтому предполагают, что синтез ДНК в них происходит только в целях репарации ДНК, которая в старческом возрасте в большей степени подвергается расщеплению [80, 81]. В клетках слюнной железы крыс синтез ДНК индуцируется изопротеренолом (изадрином), но лагпериод индукции с возрастом увеличивается, а степень индукции уменьшается [4].
Исследования, выполненные in vitro на клетках фибробластов в культуре, показали, что с уменьшением способности клеток к делению и с увеличением продолжительности клеточного цикла в поздних пассажах (фаза III) активность ДНК-полимеразы уменьшается [360]. Кроме того, в таких клетках наблюдается уменьшение количества репараций ДНК [233].
Резюме
Вся информация в организме заключена в ДНК, которая в комплексе с гистонами и НГБ образует генетический аппарат клетки, называемый хроматином. Гистоны представляют собой основные белки с малой молекулярной массой, богатые лизиновыми и (или) аргининовыми остатками, сконцентрированными в NH2– и COOH-концевых участках. Их структура в ходе эволюции оставалась неизменной. Почти все ткани содержат одни и те же типы и количества гистонов, которые не изменяются на протяжении всей жизни. Имеется пять основных типов гистонов: Н1, Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Их гены в хромосоме повторяются несколько раз и сцеплены. Гистоны синтезируются в цитоплазме в течение S-фазы и затем переходят в ядро. Будучи основными, они связываются с ДНК. Гистоны необходимы для структурной организации хроматина. Основная структура хроматина представляет собой цепочку нуклеосом диаметром ∼10 нм. Нуклеосомы имеют внутреннюю сердцевину, состоящую из октамера, включающего по две молекулы каждого из гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4, вокруг которого «обернута» ДНК. Гистон Н1 связан с межнуклеосомной ДНК, соединяющей две нуклеосомы, и участвует в создании структуры хроматина более высокого порядка.
