Текст книги "Журнал «Вокруг Света» №12 за 2008 год"

Чудный новый miR

Клеточное ядро с двойными спиралями ДНК подобно корзине, наполненной генетическими инструкциями, каждую из которых нужно сначала достать, найти подходящий абзац и скопировать на молекулу РНК. Впрочем, многие участки ДНК туго свернуты и как будто обвязаны тесемками, так что прочитать их невозможно. В разных местах на гены-инструкции могут быть пришпилены скрепки – метильные группы, также делающие их нечитаемыми. Они могут сниматься и ставиться вновь, регулируя активность генов. Фото: ALAMY/PHOTAS

В конце XIX века великий Филипп Жолли уговаривал молодого Макса Планка не заниматься теоретической физикой. Она представлялась тогда в основном законченным и потому совершенно бесперспективным делом. Планк не послушался наставника и стал одним из создателей квантовой теории. За несколько десятилетий поразительных открытий от простой и стройной физической картины мира конца XIX века не осталось и следа. Век спустя сходная картина сложилась в молекулярной генетике. К началу 1990-х годов ее здание казалось в основном достроенным, оставалось лишь объяснить несколько незначительных фактов... Однако сегодня уже ясно, что эти представления были едва ли не столь же наивны, как рассуждения о генетике в терминах Ветхого Завета. 

«Наноробот цепляет инфицированную клетку крови, ныряет внутрь нее и вставляет свой молекулярный штырь в механизм, который штампует вирусы, останавливая ее работу». Утопическая история в стиле великого прожектера нанотехнологий Эрика Дрекслера ? Никакой фантастики. Это всего лишь упрощенный пересказ научной работы, недавно опубликованной в одном из самых авторитетных научных журналов – Cell . Команда ученых из США , Южной Кореи и Германии почти добралась до чаши Грааля – им удалось остановить инфекцию вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Правда, пока только у мышей с пересаженной человеческой иммунной системой, но и это огромное достижение. Генетический аппарат, который при этом используется, 20 лет назад вообще не был известен, 10 лет считался редкой особенностью растений и червей, а сейчас за ним признают колоссальную роль в развитии всех высших организмов и ждут от него новых прорывов в медицине.

Когда гены казались простыми

Картина работы генетического аппарата представлялась в те годы довольно ясной. Генетическая информация хранится в ядре, закодированная в двойной спирали молекул ДНК. Она временно копируется на молекулы РНК, выносится ими из ядра клетки и используется для синтеза белков. Эта схема уже давно стала классической и вошла в школьные учебники. На ее основе расцвела генная инженерия – искусство целенаправленных манипуляций с генетической информацией в клетке. Казалось удивительным, что работа генетического кода устроена так остроумно и просто.

Генетический код в чем-то похож на компьютерную программу. Компьютерные инструкции записываются в цифровом виде на жестком диске компьютера, генетический код – тоже в цифровом виде на химическом носителе: двухцепочечной молекуле ДНК. С точки зрения классической генетики эта программа в неизменном виде передается из поколения в поколение. Ну или почти в неизменном – иногда случаются мутации. Процесс копирования программы во время деления клетки называется репликацией. В каждую дочернюю клетку, которая образуется в результате деления, попадает реплика, то есть точная копия каждого гена из материнской ДНК. С виду модель двойной спирали ДНК похожа на перекрученную застежку-молнию с четырьмя видами зубцов, которые стыкуются попарно. При репликации застежка-молния двойной спирали ДНК расходится, и на каждой из половинок достраивается другая лента.

Покинув ядро клетки, РНК несет генетическую депешу к огромному молекулярному комплексу – рибосоме. Здесь происходит трансляция – перевод генетического кода в структуру белковых молекул. Рибосома, двигаясь вдоль цепочки РНК (синяя), считывает код и добавляет к растущей молекуле белка (желтая) соответствующие аминокислоты. Фото: SPL/EAST NEWS

Генетическая программа должна не только копироваться, но и выполняться. В ходе ее работы создаются белки – главные молекулярные машины и строительные блоки живой клетки. Процесс происходит в два этапа. Вначале информация с ДНК транскрибируется – переписывается на другой, очень похожий носитель – молекулу РНК. От ДНК она отличается строением одного зубчика из четырех, а также основой, на которой эти зубчики сидят – она у РНК менее прочная. Причина понятна – если ДНК нужна для продолжительного хранения информации, то РНК – временный носитель, расходный материал, одноразовые дискеты или флэшки. Такая молекула РНК, на которую записана копия гена, называется информационной, или матричной (мРНК). Эта длинная цепочка – одна половинка «застежки-молнии» – может содержать до сотни тысяч зубчиков.

Когда переписывание информации завершено, мРНК выходит из клеточного ядра и встречается с рибосомой – образуется молекулярный конвейер по производству белка. Каждые три зубчика РНК кодируют один строительный блок белка – аминокислоту. Всего же в белках встречаются 20 видов таких строительных блоков, и они выстраиваются в цепочку строго в порядке, запрограммированном в РНК. Этот процесс называется трансляцией – в компьютерном мире этим термином обозначают перевод текста программы в исполняемый машинный код. Сходя с рибосомы, цепочка аминокислот сразу сворачивается и образует устойчивую трехмерную структуру. Именно в таком виде белки выполняют свои функции в клетке. Рибосомы могут неоднократно транслировать матричную РНК, раз за разом производя новые молекулы белка. Но мРНК неустойчива и через несколько часов разрушается. Поэтому считалось, что синтез каждого белка зависит главным образом от синтеза соответствующей мРНК в ядре клетки.

Конечно, схема эта сильно упрощена. Каждый из процессов – репликация, транскрипция и трансляция – мог включать дополнительные этапы. Например, выяснилось, что скопированная с ДНК молекула РНК по пути к рибосоме подвергается дополнительному редактированию – процессингу. При этом из РНК могут вырезаться значительные фрагменты кода, причем в некоторых случаях разные, а могут избирательно заменяться отдельные буквы генетического кода. Но все это не меняло сути представлений о прямой магистральной дороге от ДНК через РНК к белку.

Первые зерна сомнений по этому поводу взошли в 1990 году в горшках с петуниями по разные стороны океана. Неожиданно результаты получили специалисты из Амстердамского свободного университета и одновременно из не существующей сейчас американской компании DNA Plant Technology, которая в конце 1990-х попала под суд за махинации с трансгенным табаком.

Цвет неожиданности

Лепестки петунии могут иметь разный цвет в зависимости от активности ферментов, синтезирующих розовый или фиолетовый пигмент. Что будет с растениями, которым ввели дополнительные копии генов, кодирующие эти ферменты? Любой молекулярный биолог 20 лет назад ответил бы: разумеется, цвет лепестков станет более интенсивным. Однако заурядная работа по селекции дала парадоксальные результаты: цветки у трансгенных растений, которые должны были бы вырабатывать больше пигмента, частично или полностью теряли свой цвет. Это примерно как досыпать сахара в чай и почувствовать, что он от этого стал менее сладким.

Вскоре голландские генетики-цветоводы выяснили, что в бледных трансгенных петуниях транскрипция с ДНК на мРНК шла как обычно. Вот только трансляции, то есть синтеза белка с этих матричных РНК не происходило. Покинув клеточное ядро, они почему-то разрушались, не дойдя до рибосом. Очевидно, что механизм разрушения запускался в ответ на появление чужеродного генетического материала. А поскольку этот материал был похож на свой собственный, то механизм, тогда еще неизвестный в деталях, не разбирался и заодно уничтожал мРНК, транскрибированные с собственных генов.

На пути от ДНК к рибосоме записанный на молекуле РНК текст генетической инструкции подвергается редактированию: заменяются отдельные слова, вырезаются лишние абзацы – интроны. Происходит это так. Поскольку матричная РНК состоит из одной цепочки, а не из двух, как ДНК, каждый из составляющих ее кирпичиков-нуклеотидов стремится найти себе пару. Если в самой молекуле РНК есть «зеркальные» участки, они могут склеиться, образовав петлю, которая вскоре отрезается. В 2000 году было открыто, что в разных случаях могут вырезаться разные фрагменты РНК. Фото: SPL/EAST NEWS

Нетрудно было догадаться, зачем растениям был нужен такой механизм борьбы с чужим генетическим материалом. У них, в отличие от животных, нет иммунной системы с антителами, макрофагами и лимфоцитами. Поэтому внутриклеточная борьба с чужими генами стала одним из немногих доступных средств антивирусной защиты. На то, чтобы доказать это, ушло несколько лет. В 1997 году было показано, что растения, у которых в геноме обнаруживаются короткие «отрывки» вирусных генов, более устойчивы к действию этих вирусов. Ставили также и обратный эксперимент: в вирус подсаживали фрагмент растительного генетического кода, и в зараженном этим вирусом растении замедлялся синтез собственного белка.

Обрадовавшись, что в генетике, которая уже стала превращаться в прикладную науку, появилось что-то новое, микробиологи стали повсюду искать аналогичные механизмы. И нашли. В 1998 году американцы Крейг Мелло и Эндрю Файр (Craig Mello, Andrew Fire) опубликовали эпохальную статью про развитие круглого червя С.elegans. Это крошечное создание длиной около миллиметра с середины 1970-х годов исправно служит модельным организмом для исследований (оно даже может привыкать к никотину и страдать от абстиненции). Мелло и Файра интересовало, как влияет на развитие клеток посторонняя РНК. C.elegans был идеальной моделью для таких экспериментов – молекулы мРНК легко проникали в клетки из раствора, в котором просто вымачивали червячков. Вводимая извне мРНК, кодирующая один из важных белков C.elegans, слабо влияла на его синтез – слишком мала была выбранная экспериментаторами концентрация. Не действовала и зеркальная копия этой мРНК, так называемая антисмысловая РНК, в которой все буквы-основания заменены дополнительными к ним. Такая антисмысловая РНК способна соединяться со своей зеркальной парой подобно тому, как сцепляются нити ДНК. Ситуация резко изменилась, когда в той же концентрации червячкам вводили смесь смысловой и антисмысловой РНК. В растворе эти молекулы прилипали друг к другу, и образовавшаяся двухцепочечная РНК, несмотря на ничтожную концентрацию (всего несколько молекул на клетку!), почти полностью подавляла синтез соответствующего белка.

Спустя восемь лет Крейг Мелло проснулся среди ночи поправить постель своей дочери и заметил, что телефон беззвучно мигает зеленой лампой – звонок был выключен. Часы показывали 4.30. «Жена сказала, что уже снимала трубку, – вспоминал потом Мелло, – и какие-то шутники разыграли ее, будто бы я получил Нобелевскую премию. Но я все-таки ответил». Это была не шутка. Объявление шведского Каролинского института в 2006 году гласило: «Нобелевские лауреаты этого года открыли фундаментальный механизм, который контролирует поток генетической информации».

Приманка для мясорубки

Проникнув в клетку, двухцепочечная РНК попадает в жернова механизма, настроенного специально на ее обработку, о существовании которого 10 лет назад никто и не подозревал. Первым делом на вторгшуюся молекулу набрасывается шинковальная машина, аккуратно разрезающая ее на кусочки длиной в 21—23 основания. Эти кусочки получили название малой ингибирующей РНК, или siRNA. Данную аббревиатуру сегодня можно часто встретить в сообщениях о новых лекарствах для борьбы с вирусными заболеваниями и раком.

Белок, который шинкует РНК, получил название Dicer, от английского слова dice – нарезать кубиками. Открыли его целенаправленно, вычислив на компьютере структуру молекулы. Видя, что попавшая в клетку длинная двухцепочечная РНК разрушается, ученые примерно представили, как должен выглядеть фермент, приводящий к такому эффекту, затем нашли участки генома, в которых он мог быть закодирован, и в конце концов синтезировали по ним белок.

Путь от ДНК к рибосоме полон опасностей. Особые RISC-комплексы охотятся прежде всего на РНК, несущие вирусный генетический код. Свою жертву RISС-комплекс определяет по коротким фрагментам РНК – микроРНК (miR), оставшимся от прежних жертв. Но этих охотников можно нацелить и на глушение активности собственных генов клетки, если специально «подбросить» им микроРНК с соответствующими фрагментами кода. Это открывает перспективу лечения различных заболеваний, в том числе генетических. Фото: SPL/EAST NEWS

Нарезанные siRNA становятся наживкой, на которую ловятся путешествующие в клетке мРНК. С наживки снимается предохранитель – уходит одна из двух цепочек siRNA. Оставшаяся одиночная цепь заряжается в сложный белковый капкан, называемый RISC-комплексом. Матричная РНК, похожая на ту, которая разрезалась на короткие siRNA, клюет на эту приманку, оказывается в мясорубке RISC, где и разрезается на мелкие кусочки. Для синтеза белка она после этого потеряна.

Этот механизм запускается с любого этапа – например, появление в клетке уже готовых, нарезанных siRNA провоцирует сборку RISC и уничтожение матричных РНК, с участками которых совпадают siRNA. Клетки растений, как выяснилось, могут передавать siRNA друг другу по системе межклеточных каналов. Таким образом, клетки, которые ни разу не встречались с чужеродным генетическим материалом, оказываются готовы к тому, чтобы этот материал уничтожать.

Некоторое время считалось, что сложным механизмом реакции на чужую РНК обладают только растения и примитивные животные вроде C.elegans, обделенные настоящей иммунной системой. Однако вскоре шинковку Dicer и детали мясорубки RISC обнаружили у птиц, млекопитающих, животных и человека. Об актуальности этого антивирусного механизма свидетельствуют и сами вирусы, которые в ходе эволюционного противостояния «снаряда и брони» обзавелись собственными приспособлениями для борьбы с siRNA. Среди них, например, специальные белки, которые тормозят работу RISC-комплексов. Эти средства чрезвычайно распространены у растительных вирусов, но их нашли и у вирусов млекопитающих.

Открытие siRNA подарило новые надежды на лекарства от вирусных и онкологических заболеваний, а молекулярным биологам – заодно и надежды на новое финансирование. Помимо упоминавшегося препарата против ВИЧ, уже испытываются основанные на siRNA лекарства от рака поджелудочной железы и шейки матки, а также от макулярной дистрофии – одной из главных причин потери зрения в пожилом возрасте.

Бывший президент Стэнфордского университета Дональд Кеннеди, который до недавнего времени возглавлял журнал Science, считал, что перелом в генетике случился в 2007 году, когда «фокус исследований сместился с генетической последовательности к взаимной регуляции генов». Не слишком ли сильно сказано для аппарата siRNA, который, кажется, нужен только для защиты от внешнего генетического материала?

Генетический тормоз

В то самое время, когда ботаники-генетики по обе стороны океана удивлялись бледнеющим петуниям, Виктор Амброс с коллегами из Гарвардского университета изучал серьезные нарушения в развитии все тех же червячков C.elegans, вызванные мутацией в гене, обозначаемом lin-4. Для этого нужно было найти белок, за который отвечал мутантный ген. Скрупулезно проходя ДНК участок за участком, Амброс с коллегами сделали открытие, которое дало больше вопросов, чем ответов. Ген lin-4 оказался очень маленьким – всего 21 нуклеотидное основание – и вообще не кодировал никакой белок.

Намек на разгадку дала последовательность гена-коротышки. Она зеркально воспроизводила фрагмент гена, кодирующего белок LIN-14. Именно этот белок в аномально высоких концентрациях производился у мутантов с нарушениями в lin-4. Стало ясно, что правильный ген lin-4 каким-то образом блокирует избыточный синтез данного белка. Так исследователи впервые натолкнулись на доселе неизвестный механизм регуляции активности генов. Но еще несколько лет считалось, что найденный механизм – экзотика, присущая только червям.

Нематоды Caenorhabditis elegans – круглые черви длиной около миллиметра – один из широко используемых генетиками модельных организмов. 

Перелом наступил только в 2000 году, когда другая команда исследователей во главе с Гэри Равканом из Массачусетского госпиталя в Бостоне нашла такой же короткий ген let-7. В отличие от lin-4 он блокировал образование не одного, а сразу пяти белков. Вскоре Равкан показал, что let-7 встречается у самых разных животных. А его близкий аналог нашелся в расшифрованном к тому времени человеческом геноме. Это уже нельзя было списать на экзотику круглых червей, поскольку эволюция сохранила их практически в неизменном состоянии у самых разных видов. Стало ясно, что открытый механизм играет важную роль для всего живого, позволяя регулировать активность генов с помощью собственных тормозящих РНК. Эти молекулы получили название микроРНК, miRNA или совсем коротко – miR.

К исследованиям малых ингибирующих РНК подключилось множество лабораторий по всему миру. Но каждая из них сообщала о своих результатах так, будто смежных областей просто не существует. Например, исследователи miRNA некоторое время упорно считали единственным назначением siRNA защиту от вирусов, которая никак не связана с развитием организма. Исследователи siRNA, в свою очередь, полагали, что miRNA – всего лишь частный случай механизма уничтожения матричных РНК. Специалисты до сих пор еще не договорились по этим вопросам, однако сегодня у miRNA и siRNA можно найти больше сходств, чем различий.

Эти два типа малых РНК очень близки по размеру (21—25 оснований). Смысл существования обоих – подавление трансляции белка с матричной РНК. И miRNA и siRNA готовятся при помощи шинковки Dicer. Но если две половинки siRNA-основания плотно держатся вместе, пока эта короткая РНК не попадет в капкан RISC, то miRNA путешествует по клетке в виде одиночных цепочек. Путь обеих малых РНК заканчивается ролью наживки в комплексе RISC. Причем в случае siRNA эта наживка обычно очень хорошо подходит к мРНК-мишени, а в случае miRNA может слегка от нее отличаться.

Раньше считалось, что взаимодействие с siRNA ведет к немедленному уничтожению матричной РНК, а взаимодействие с miRNA просто блокирует ее до тех пор, пока она не разрушится в клетке естественным путем. Сегодня все уже не так однозначно – обнаружены разрушающие и неразрушающие комплексы RISC, причем и те и другие могут взаимодействовать c обоими типами коротких ДНК.

Пожалуй, самое важное различие между siRNA и miRNA – точность совпадения их последовательности с РНК-мишенью. У siRNA оно абсолютное, и поэтому действие этой молекулы очень избирательное – как правило, она блокирует только одну последовательность матричной РНК, а значит, синтез одного белка. Напротив, miRNA не так хорошо пристает к своей мишени, но зато может связываться сразу с несколькими похожими РНК.

Есть и еще одно несходство: за открытие siRNA Мелло и Файр уже стали нобелевскими лауреатами, а обнаруживший miRNA Амброс своей премии пока так и не дождался.

Сложнее, еще сложнее

Описывать жизнь простой схемой «ДНК – РНК – белок» сейчас действительно кажется наивным. В человеческом геноме уже найдено 695 микроРНК, и скоро это число, возможно, дойдет до 1000. Между тем у человека всего около 20 000 генов, кодирующих белки. Если учесть, что каждая микроРНК влияет на работу нескольких из них, то выходит, что под контроль микроРНК попадает около трети человеческого генома. И это еще консервативные оценки. Самые смелые экстраполяции рисуют картину, в которой число микроРНК превышает число белковых генов. Все это складывается в невыразимо сложную систему регуляции, ведь малые РНК влияют не только на матричные РНК, но и друг на друга. Клетки вырабатывают их, чтобы бороться с вирусами, а вирусы противодействуют этому, внося в клетку свои антипоследовательности.

Этажи регуляции можно надстраивать друг над другом. Например, блокировать miRNA с помощью siRNA, отпуская тем самым тормоз синтеза сразу множества белков. И такие подходы уже используются в терапии. Например, блокируя miR-122, которая встречается в основном в печени, можно лечить гепатит и регулировать синтез холестерина. Опыты на животных показали, что таким способом удается снизить его уровень в крови на 40%.