Текст книги "Человек редактированный, или Биомедицина будущего"

Автор книги: Сергей Киселев

сообщить о нарушении

Текущая страница: 9 (всего у книги 12 страниц)

Редактирование генома

«Генетическое лекарство»

Достижения генетики и генной инженерии в области обеспечения человечества пищей несомненны и общепризнаны, как бы ни относились к генетически модифицированным организмам отдельные люди, незнакомые с существом дела. Однако не меньшую важность для здоровья человека, чем предотвращение голода, представляет решение чисто медицинских проблем. Использование редактирования генома в сфере медицины не просто перспективно – от него ожидают совершенно потрясающих вещей. Некоторые экспериментальные и даже клинические исследования уже активно обсуждаются, тестируются и начинают шаг за шагом входить в нашу жизнь.

Давайте посмотрим, как развивались методы редактирования генома в области биомедицины и как разрабатывались те или иные стратегии и подходы к лечению заболеваний человека.

Одной из первых прорывных публикаций в этой области была замечательная статья, опубликованная в журнале Nature Biotechnology в 2014 году. Исследование, выполненное авторами статьи, заключалось в следующем. Ранее с использованием мутагенеза была создана модельная мышь, у которой в определенный ген была введена точечная мутация, приводившая к проявлению такого заболевания человека, как наследственная тирозинемия первого типа. При этой патологии происходит накопление токсических метаболитов, в первую очередь в гепатоцитах – специализированных клетках печени, ответственных за общую дезинтоксикацию организма, что приводит к их гибели и вызывает общее отравление организма. Накопление токсичных продуктов обмена и гибель гепатоцитов могут быть приостановлены лекарственным препаратом, при условии, что пациенты всю жизнь будут следовать очень строгой диете. То же самое было необходимо и модельной мыши с этим заболеванием: отмена лечения приводила к гибели животного.

Ученые задумались, можно ли вылечить эту мышь с помощью метода геномного редактирования, для чего сделали соответствующие генетические конструкции. Они подобрали и синтезировали определенную направляющую РНК, которая должна была связываться с последовательностью ДНК именно в месте мутации, а затем с помощью генной инженерии создали векторную генетическую структуру, которая включала эту направляющую РНК и белок Cas9. Была также синтезирована последовательность длиной в двести нуклеотидов, полностью идентичная последовательности гена «дикого» типа, то есть нормальной копии гена, без мутации. Ученые ввели в хвостовую вену мыши эти «лечебные» генетические последовательности, вместо того чтобы сделать укол лекарством, который она ежедневно получала. По сути, исследователи ввели мышке «генетическое лекарство».

Нужно отметить, что эта работа удачно сочетала в себе грамотный подход к методике проведения эксперимента с правильным выбором модельного организма. Инъекция в хвостовую вену мыши – обычная процедура, так как она хорошо заметна на голом мышином хвосте и ведет напрямую к воротной вене печени, то есть если мы вводим в хвостовую вену какое-то вещество, то оно очень быстро попадает в печень. Таким образом, «генетическое лекарство» – конструкции с направляющей РНК/Cas9 и фрагмент ДНК, необходимый для замещения мутантной последовательности, – попадало прямо в гепатоциты, которым необходимо лечение. Направляющая РНК находила среди миллиарда букв генетического текста мыши необходимое место и комплементарно связывалась с ним, а фермент Cas9 вносил разрыв в структуру ДНК.

Рис. 8. Благодаря системе CRISPR/Cas ученые могут точечно заменять какие-либо участки ДНК, как будто орудуют мини-ножницами

При появлении разрыва клетка тут же пытается заделать эту брешь, а если рядом находится фрагмент с гомологичным текстом (по сути, «кирпичик», по форме идеально сходный с брешью), то он и замещает оригинальный фрагмент ДНК за счет гомологичной рекомбинации. Теперь вместо фрагмента текста с ошибкой вставлен правильный (см. рис. 8).

РЕДАКТИРУЮЩАЯ МЕДИЦИНА

Этот потрясающий эксперимент с геномным редактированием печени мышек недолго оставался чисто научным достижением. Вскоре на основе этого исследования была создана американская коммерческая компания Editas Medicine, то есть редактирующая медицина, или медицина редактирования, которая тут же привлекла более сорока миллионов долларов для развития, когда разместила свои акции на рынке ценных бумаг. Вот так одна публикация, вроде бы простая, но хорошо продуманная, дает мощный толчок и развитию технологии, и быстрой коммерциализации. Надо отметить, что тут еще не идет речи о лечении человека, а только получено доказательство его возможности. Но коммерческие компании, имеющие или купившие право на использование данного открытия, сразу же стараются привлечь средства для движения вперед, так как вполне очевидно, что в будущем этот небольшой научный эксперимент может быть использован и для терапии человека.

Мышкам, которым ввели это «генетическое лекарство», теперь не нужно было принимать специальные препараты и сидеть на диете – они выздоровели! Конечно, не все оказалось просто. Для своих экспериментов исследователи решили использовать три разных направляющих РНК. Все три распознавали генетический текст вблизи мутации, но были сдвинуты относительно друг друга на один-три нуклеотида. Только одна направляющая РНК позволила подопытным животным отказаться от медикаментозного лечения, остальные оказались не настолько эффективны. Для этого варианта направляющей РНК мутация была исправлена в одной из каждых трехсот клеток. Но даже столь небольшой доли исправлений оказалось достаточно, чтобы полностью отменить прием лекарственного препарата. И это на всю жизнь!

Но при всех блестящих успехах генетических технологий, как и при использовании любых других вмешательств в человеческий организм, всегда остается проблема побочных эффектов. А не могут ли они возникнуть и от «генетических лекарств»? Это не исключено. Мы говорили, что направляющая РНК узнает порядка двадцати букв генетического текста, но с особой точностью распознает лишь первые три-пять букв, а чем дальше, тем более снижается точность узнавания. Поскольку у человека три миллиарда букв генетического текста, то какие-то повторения, безусловно, возможны. Например, слово из пяти букв мы найдем в генетическом тексте не один, а очень много раз, поэтому существует вероятность, что выбранная нами направляющая РНК некорректно узнает нужный или ошибочно распознает еще и ненужный текст. Мы сами, когда что-то переписываем, можем нечаянно пропустить букву или написать не ту, в результате чего исказится смысл слова, фразы, всего текста. Так и ошибка направляющей РНК, в принципе, может вызвать нежелательные последствия: где-то в другом месте генома тоже произойдет распознавание, разрезание и какое-то замещение. Это и есть побочные эффекты, которых боятся при использовании технологии геномного редактирования.

Стоит ли нам опасаться чего-нибудь подобного в описанном эксперименте? Предположим, направляющая РНК распознает в клетках печени взрослой мышки (а больше никуда при таком методе терапии она не попадает) некий фрагмент генома и изменит его. В каких-то клетках исправит нужное, а в других распознает нечто иное. Есть такая вероятность, хотя гены занимают в геноме чуть больше процента от трех миллиардов букв, и возможность того, что введенная в организм генетическая конструкция сломает какой-то важный ген, очень невысока. Да и произойдет это в клетках, которые и так «больны». К тому же нет и не может быть лекарств, вообще не имеющих побочных эффектов. С точки зрения сохранения генома человека как вида не следует бояться этих изменений, ведь то, что мы лечим, касается только клеток взрослого организма – соматических. Эти изменения уже не передаются по наследству. Даже если нечаянно внести ошибку и затронуть еще какой-то генетический текст, он в любом случае не будет унаследован нашими потомками, потому что изменения проводятся не в клетках зародышевого пути.

Мы поговорили только об одном варианте «генетического лекарства», в котором используется система геномного редактирования. С тех пор на мышиных моделях было проведено много экспериментов и по использованию геномного редактирования для лечения инфекционных заболеваний (таких, например, как СПИД, вирусный гепатит В, поражения вирусом папилломы человека), заболеваний опорно-двигательного аппарата (миодистрофия Дюшенна), зрения и многих других.

Генетическое редактирование иммунной системы

Работа по геномному редактированию у мышей, о которой мы говорили, была опубликована в 2014 году, но прошло всего года два, и эта технология была впервые испытана на человеке. Но это, опять-таки, касалось только изменения генетического текста в некоторых соматических клетках взрослого организма. Авторы работы, китайские ученые, на этот раз выбрали заболевание из области онкологии. С помощью системы геномного редактирования CRISPR/Cas9 они решили изменить определенный ген в клетках крови больных раком легких таким образом, чтобы лимфоциты могли уничтожать опухолевые клетки. Но для того, чтобы этот небольшой технологический эксперимент состоялся, множество ученых во всем мире работали не один десяток лет, стараясь понять, почему иммунная система человека позволяет появляться опухоли. В итоге оказалось, что опухолевые клетки сами блокируют иммунный ответ. За открытие данного явления и способа преодоления такой блокировки американскому исследователю Джеймсу Эллисону и его японскому коллеге Тасуку Хондзё была вручена Нобелевская премия по медицине в 2018 году. Чем же так примечательно это открытие?

Мы уже обсуждали в главе 4 принцип работы иммунной системы человека. Как вы помните, встреча с ослабленным патогеном или его частью – антигеном – приводит к иммунному ответу и формированию иммунологической памяти. Если патоген проникнет в организм в следующий раз, то эти клетки иммунной системы быстро организуют эффективный отпор, помня ранее встреченный антиген. Так происходит с теми лимфоцитами, которые нашли свою мишень, то есть соответствующий антиген. Однако миллионы других рецепторов – «ключей», не нашедших свою «замочную скважину», – погибают вместе со своими носителями-лимфоцитами, так как в данный момент они оказались ненужными. Однако им на смену генерируется новый пул разнообразных В– или Т-клеток. Каждый Т-лимфоцит, чей рецептор случайно распознал какой-то патоген, получает право на жизнь, активируется и дает клоны.

Считается, что одну из главных ролей в противоопухолевом ответе играют Т-лимфоциты, которые, непосредственно распознавая опухолевую клетку и связываясь с ней, должны ее уничтожить. Почему же так происходит не всегда и опухолевые клетки избегают надзора со стороны иммунной системы? Увы, антигены есть у всех клеток, они имеются не только на патогенах, но и на любой клетке нашего собственного организма. И конечно же, сгенерированный иммунной системой случайный набор вариантов Т-лимфоцитов с их, как говорят, «репертуаром» клеточных рецепторов будет распознавать и собственные клетки. А вот это как раз нам совсем не нужно! Ведь если лимфоцит распознает собственные клетки, это приведет к возникновению аутоиммунитета – явления, охватывающего большой класс тяжелых болезней, называемых аутоиммунными заболеваниями, когда иммунная система организма уничтожает его собственные здоровые клетки и ткани.

И природой мудро придумано, как избежать возникновения аутоиммунного ответа. Для этого на поверхности Т-клетки имеется «нобелевский лауреат» – особый рецептор под названием PD1 (programmed [cell] death, или программируемая [клеточная] смерть). В названии заложена его функция. Если Т-лимфоцит может случайно распознать клетку нашей собственной ткани, то ничего страшного не произойдет, для блокирования этого имеется ответная часть для «нобелевского лауреата» PD1 – так называемый PD1-лиганд. Если при взаимодействии PD1-лиганд связывается с PD1-рецептором, то Т-лимфоцит получает сигнал на программируемую смерть. Таким образом осуществляется обратная связь с иммунной системой, которая случайным образом сгенерировала вариант распознавания своей ткани, своего антигена.

Так и должно происходить в норме, но мы знаем, что порой аутоиммунитет все-таки развивается. Далеко не все системы совершенны, и возможен сбой: например, если Т-лимфоцит по каким-то причинам не распознает на поверхности клетки PD1-лиганд, возникает аутоиммунное заболевание.

К сожалению, бывают случаи, когда нормальная клетка организма ошибается и становится трансформированной клеткой. В результате у нее появляются шансы сформировать опухоль.

Считается, что для того, чтобы клетка стала трансформированной, в ней должны произойти от трех до семи генетических изменений, приводящих к тому, чтобы она стала активно делиться, перестала реагировать на внешние сигналы, стала эгоистичной и бессмертной. Таким образом, опухолевая клетка претерпевает долгую эволюцию, прежде чем сформировать опухолевую ткань.

Но ведь когда-то она была нормальной клеткой организма, и многие черты нормальной клетки у нее остались. В частности, на поверхности большинства опухолевых клеток остался PD1-лиганд. И вот представьте себе: к трансформированной клетке подходит Т-лимфоцит и распознает опухолевый антиген. Как бы хорошо было, чтобы наш лимфоцит немедленно активировался, начал делиться и убивать все опухолевые клетки, в которых этот антиген сидит. Увы, этого не происходит, ведь на каждой из опухолевых клеток находится PD1-лиганд. Он связывается с PD1-рецептором на поверхности Т-клетки и говорит этому лимфоциту: «Не тронь, погибни!»

И вот тут мы подошли к ответу на вопрос, за что была дана Нобелевская премия: за открытие иммунологических «тормозов» в виде молекул PD1 и CTLA4 и возможность использования этого явления для терапии рака. Оказалось, что можно сделать генно-инженерным путем рекомбинантное антитело, которое будет связываться с PD1-рецептором и предотвращать его взаимодействие с PD1-лиганд ом клетки. Это примерно то же самое, как если бы мы на Т-лимфоцит надели чехол – мы его изолировали. Теперь Т-клетка связывается с опухолевым антигеном, но не получает сигнала погибнуть, поскольку PD1-рецепторы изолированы, а получает сигнал на размножение и начинает убивать опухолевые клетки в организме. Эти противоопухолевые средства, направленные на так называемые контрольные точки иммунитета, появились в последние шесть-семь лет и оказались эффективными в лечении ряда онкологических заболеваний, существенно изменив качество жизни многих пациентов.

На этом примере видно, с одной стороны, как непросто устроено все в природе, а с другой – какие возможности дает человеку детальное знание функционирования очень специализированных клеток организма – Т-лимфоцитов крови. Мы уже говорили, что кровь – весьма удобная ткань, с которой медицина уже давно и успешно работает. Можно даже выделить из крови персональные Т-лимфоциты, чем и решили воспользоваться китайские ученые.

Они взяли у пациентов, страдающих раком легких, Т-клетки – это довольно простая процедура под названием лимфоцитоферез, когда кровь просто прокачивается через специальный аппарат, в котором клетки крови разделяются, и можно безопасно выделить тот или иной тип лимфоцитов. Затем с помощью технологии геномного редактирования CR1SPR/Cas9 инактивировали у них PD1-рецепторы и ввели лимфоциты обратно. Теперь уже не требовалось вводить какие-то антитела пациентам, потому что у них часть Т-лимфоцитов фактически не имела PD1-рецепторов. Такой генетически отредактированный Т-лимфоцит распознавать опухолевый антиген сможет, а сигнала на самоуничтожение через PD1-рецептор не получит, и эти Т-клетки будут атаковать опухоль.

Это очень хороший пример, когда подвергается редактированию, а в данной работе – инактивируется определенный ген взрослого организма, находящийся в нужных клетках, в нашем случае в Т-лимфоцитах. Это необходимо потому, что экспрессия (то есть нормальное проявление гена) в данной ситуации мешает борьбе организма с опухолью. Однако надо понимать, что только часть Т-клеток станет обладать противоопухолевым действием, остальные по-прежнему будут нести на себе этот рецептор.

К сожалению, эффективность этой терапии пока оказалась не очень высокой. Всего в клинических испытаниях принимало участие около тридцати пациентов, и по результатам, опубликованным в 2018 году, положительный ответ на лечение наблюдался только у тридцати процентов. Но ведь мы еще только в начале пути! Ответ на противоопухолевую терапию даже у тридцати процентов больных – это уже хорошо. Конечно, процедуру надо усовершенствовать, повысить эффективность и сохранить безопасность. Возможно, имеет смысл выбрать другое заболевание, где эффект от блокирования «иммунологических контрольных точек» более значителен. При оценке успеха надо еще учитывать, что клинические испытания разрешено применять только на больных третьей и более поздних стадий прогрессирования рака: считается, что на более ранних стадиях риск может превышать ожидаемую пользу. Пациенты, на которых проводилось обсуждаемое нами исследование, были в очень тяжелом состоянии, и ожидать какого-то чуда и большей эффективности, чем эти полученные тридцать процентов, наверное, не стоило.

Перспективные мишени генной терапии

Несмотря на то что мы очень точно нацеливаемся на тот или иной ген, то есть на очень короткую и определенную последовательность генетического текста, все наши манипуляции с генами подпадают под термин генная терапия, потому что мы в лечебных целях либо инактивируем, либо восстанавливаем гены. Примером генной терапии является описанная выше технология, когда китайские ученые ввели в Т-лимфоциты определенную генетическую конструкцию, чтобы инактивировать ген PD1 и повысить эффективность противоопухолевой борьбы.

Генная терапия может осуществляться двумя разными способами. Один из них – ex vivo (вне организма), когда клетки извлекают из организма, проводят манипуляцию с их генами и снова возвращают в организм, как в указанной работе китайских ученых. Другой подход – in vivo (в организме) – мы рассматривали, обсуждая эксперимент с мышкой, которой в хвостовую вену вводили «генетическое лекарство» – специальную генетическую конструкцию, приводившую к излечению.

Сегодня для проведения генной терапии имеется очень большое количество перспективных мишеней. Например, в портфеле швейцарской биотехнологической компании CRISPR Therapeutics, одним из учредителей которой является Эмманюэль Шарпантье, лауреат Нобелевской премии за создание системы CRISPR/Cas9, предусмотрено использование технологий геномного редактирования для лечения десятка заболеваний.

В первую очередь в планах CRISPR Therapeutics – болезни крови и иммунные заболевания, к которым относятся бета-талассемия, мелкоклеточная анемия и тяжелый комбинированный иммунодефицит. Поскольку речь идет о клетках иммунной системы – лимфоцитах, это уже хорошо отработанная процедура, как мы разобрали на примере работы китайских ученых, и она может быть применена очень эффективно.

В США уже идут клинические испытания первой и второй фазы генной терапии бета-талассемии и мелкоклеточной анемии, и я думаю, что скоро мы узнаем о том, насколько успешными они оказались.

Другая мишень компании – терапия онкогематологических заболеваний, то есть онкология, связанная с кровью. Сегодня для лечения B-клеточных лимфом все шире используется генно-терапевтический подход, который называется CAR-Т, или химерный антигенный Т-клеточный рецептор (Chimeric Antigen Receptor 7). Мы уже немного говорили о Т-клетках и о том, что по разным причинам опухоль ускользает от поражения Т-лимфоцитами. Но знания в области молекулярных механизмов иммунного ответа становятся все глубже, и теперь с помощью генной инженерии можно собрать химерный Т-клеточный рецептор. Почему он химерный? Потому что мы уже имеем возможность генно-инженерным путем собрать конструкцию, которая будет содержать фрагмент антитела, распознающего опухолевый антиген В-клеточной лимфомы, добавить к фрагменту этого антитела фрагмент Т-клеточного рецептора, проходящего через клеточную мембрану, а к внутриклеточной части Т-клеточного рецептора добавить еще целый ряд фрагментов от других рецепторов, необходимых для эффективного устранения опухолевой клетки. Собранную таким образом генетическую конструкцию вводят в Т-клетки, а потом уже эти клетки вводятся пациенту. И возникает противоопухолевый ответ. Это, конечно, не очень простая и достаточно дорогая технология, поскольку манипуляция с клетками пациента выполняется вне его организма. Но альтернативной терапии для этих людей нет, поэтому приходится прибегать и к такому подходу.

Я еще раз хочу напомнить, что во всех случаях генетического редактирования, о которых мы до сих пор говорили, генные исправления делались в соматических клетках, и все эти исправления не будут наследоваться.