Текст книги "Танец жизни. Новая наука о том, как клетка становится человеком"

Автор книги: Роджер Хайфилд

Соавторы: Магдалена Зерницка-Гетц
сообщить о нарушении

Текущая страница: 10 (всего у книги 17 страниц)

Мы не могли создать мозаичный эмбрион, поскольку не могли обработать реверсином лишь несколько клеток в пределах одного эмбриона, чтобы сделать их аномальными, и выбрали альтернативный подход, основанный на создании химер из клеток разных эмбрионов (мозаичный эмбрион развивается из одной оплодотворенной яйцеклетки). Химеры были предпочтительнее мозаичных эмбрионов, потому что позволяли планомерно выяснить, какое количество аномальных клеток нарушает процесс развития. К счастью, подход сработал.

Хелен обработала каждый эмбрион реверсином в момент перехода из двухклеточной стадии в четырехклеточную, а по достижении восьмиклеточной стадии разделила эмбрион на отдельные. Затем она смешала четыре клетки нормального эмбриона с четырьмя клетками обработанного реверсином и получила восьмиклеточный химерный эмбрион.

Чтобы отследить судьбу каждой клетки, нужно было найти маркер. Мы воспользовались линией мышей, созданных моими друзьями из Нью-Йорка, Кэт Хаджантонакис и Джинни Папайоану, с генетическими изменениями, способствующими экспрессии GFP в клеточном ядре [2]. Мы использовали эмбрионы этих мышей для того, чтобы обработанные и необработанные реверсином клетки были разного цвета – только так их можно было отличить. Клетки, экспрессирующие GFP, визуально демонстрировали точное время и место рождения новой клетки, ее последующие деления, а также время и место смерти, если клетка не выживала. Так мы могли нарисовать для каждой клетки целое «фамильное древо».

Мы снимали фильмы о судьбе индивидуальных клеток, как уже делали однажды, когда пытались понять, в какой момент клетки эмбриона склоняются на определенный путь развития (глава 4). Хелен наблюдала прямо на экране, как количество аномальных клеток уменьшалось преимущественно в той части эмбриона, которая генерировала ткани нового организма, то есть в эпибласте. Аномальные клетки умирали в процессе апоптоза – запрограммированной клеточной гибели. Частота апоптоза в той части эмбриона, которой суждено было стать собственно эмбрионом, была более чем в два раза выше среди обработанных реверсином клеток, чем среди контрольных, необработанных.

Эксперимент показал, что аномальные клетки в основном уничтожались в той части эмбриона, которая должна была превратиться в плод. Это подтверждало мою гипотезу о том, что аномальные клетки в этой части эмбриона проигрывают нормальным, хотя я не угадала сам механизм.

Мне даже не верилось. Это был первый намек на то, что мы и впрямь на что-то наткнулись и что эмбрион способен к самовосстановлению точно так же, как и к самоорганизации.

(Когда я еще носила под сердцем Саймона, могло ли случиться так, что клетки с хромосомной аномалией, чьих потомков показал тест CVS, самоликвидировались в той части эмбриона, которая превратилась в Саймона? Но в тот день я поехала забирать Саймона из школы и все ему объяснила, хотя сомневалась, что он поймет. Но тем вечером, пока мы с ним рисовали и танцевали, я уверена, он осознал, что произошло нечто судьбоносное.)

Хотя сердце стучало «да-да», рациональный ум говорил «может быть». Прежде чем делать однозначный вывод, предстояло столько всего исследовать. Например, судя по моему тесту (как и по любому аномальному результату теста CVS), аномальным клеткам удается попасть в трофэктодерму, которая превращается в плаценту. Но почему они не ликвидируются путем апоптоза? Является ли эта часть эмбриона более терпимой к клеткам с хромосомными аномалиями? Как выглядит сигнал, запускающий механизм уничтожения аномальных клеток? Они убивают себя сами или при помощи окружающих нормальных клеток, «выигравших» конкурс на выживание?

По ряду причин, от бытовых до научных, на изучение этих вопросов ушли годы, да и ответить удалось только на некоторые. Например, мы выяснили, что в трофэктодерме аномальные клетки выживают, хотя делятся медленнее. Исследование 1346 индивидуальных клеток показало, что в трофэктодерме апоптоз происходит не так часто (2% клеток), но опять же, частота апоптоза среди аномальных клеток выше (3,3%), чем среди контрольных (0,6%). Аномальные клетки постепенно продолжают делиться, рождая потомство для будущей плаценты, поэтому их можно обнаружить в результате анализа, например, того самого теста CVS, который я проходила. Мы предполагаем, что у человеческих эмбрионов происходит то же самое.

Эти эксперименты показали, что та часть эмбриона, которая развивается в собственно эмбрион, а затем – в мышонка, может самостоятельно избавляться от клеток с аномальным набором хромосом. Эмбрион оказался способен как к самоорганизации, так и к самовосстановлению. Это был существенный результат. Однако важно подчеркнуть, что не все аномальные клетки были уничтожены. Происходит ли это позже? Продолжается ли подобная самокоррекция после имплантации? Мы не могли тогда выяснить, поскольку еще не умели культивировать эмбрионы после стадии имплантации. Этот оставшийся вопрос только сильнее мотивировал меня на то, чтобы придумать способ выращивания эмбриона после имплантации в культуре.

Работа была не закончена. Оставался центральный вопрос о том, могут ли уцелевшие в мозаичном эмбрионе нормальные клетки компенсировать уничтоженные аномальные. И самое главное: если могут, то какое количество нормальных клеток должно присутствовать в мозаичном эмбрионе, чтобы обеспечить его восстановление?

В поисках ответа мы решили создать мозаичные химерные эмбрионы, у которых соотношение контрольных (нормальных) клеток к обработанным реверсином (аномальным) клеткам составляло 1:1 или 1:3, а затем подсадить их приемным самкам. Вскоре после имплантации Хелен их извлекла. Поразительно, но все мозаичные эмбрионы 1:1 выглядели такими же нормальными, как контрольные, указывая на то, что, если в эмбрионе остается лишь половина нормальных клеток, их по-прежнему достаточно для развития и восстановления. Как и следовало ожидать, среди мозаичных эмбрионов 1:3 было гораздо меньше жизнеспособных, хотя кое-кто все-таки спасся, несмотря на то, что на 75% состоял из аномальных клеток.

Полученные данные позволяли предположить, что смертельного эффекта аномального количества хромосом можно избежать, если в эмбрионе достаточно нормальных клеток.

Но мы ничего не могли допустить просто так. Для абсолютной уверенности Хелен еще раз создала мозаичные эмбрионы, но в этот раз позволила им развиваться в приемных самках на всех стадиях беременности. Из тринадцати мышей у семи не осталось ни одной клетки, обработанной реверсином. Все мышата выжили и не имели признаков нарушенного здоровья.

Насколько известно, это был первый случай, когда кто-то продемонстрировал прогрессивное уменьшение количества анеуплоидных клеток в эмбрионе млекопитающего и доказал, что это происходит с помощью разных механизмов, в зависимости от клеточной линии.

Можно было заключить, что мозаичные эмбрионы, вероятно, выживают при условии наличия достаточной доли клеток с нормальным набором хромосом. Удивительно, но после уничтожения аномальных клеток их заменяют нормальные, тем самым восстанавливая эмбрион. Однако в той части эмбриона, которая превращается в плаценту, присутствие аномальных клеток допустимо – они просто медленнее делятся. Я всегда надеялась, что существует нечто подобное, и так захватывающе было обнаружить веские доказательства своей догадки. Но опять-таки должна подчеркнуть, что результаты были получены на мышах, а когда дело касается клиники, то здесь необходимо провести больше исследований, чтобы посмотреть, применимо ли то же самое к человеческим эмбрионам. Тем не менее в главе 10 мы обсудим недавно полученные доказательства того, что некоторые мозаичные эмбрионы действительно могут развиваться в здоровых новорожденных.

Вечная проблема публикации

Хелен успешно защитила диссертацию по результатам исследований мозаичных эмбрионов и покинула лабораторию для продолжения своей медицинской карьеры раньше, чем у нас получилось превратить ее исследования в статью в научном журнале. Эта конкретная статья была важна для меня не только в плане научных достижений, но и как помощь в понимании результатов теста CVS, которая могла пригодиться другим парам, столкнувшимся с похожей дилеммой.

Однако первую представленную нами рукопись отклонили. Рецензенты попросили нас провести как можно больше дополнительных исследований. К тому времени в моей команде появился еще один аспирант, Сара Грэхем, которая только что закончила свою диссертацию и заняла должность постдока, финансируемую моей стипендией от Wellcome Trust. Сара оказалась внимательным и талантливым эмбриологом и проделала огромную работу для завершения нашего проекта.

Мне также посчастливилось воспользоваться усилиями других великолепных ученых с подходящим набором навыков. Чтобы узнать подробнее, каким образом реверсии вызывает аберрации ДНК, мы обратились к Тьерри Воэту и его команде, изучавшим генетические модификации в Центре Сенгера и разрабатывавшим способы изучения генетических изменений отдельных человеческих клеток. С помощью Тьерри мы смогли применить метод секвенирования ДНК одиночной клетки и, проанализировав изменения ДНКв клетках из обработанных и необработанных эмбрионов, продемонстрировать, что реверсии действительно вызывает хромосомные аномалии. Метод подтвердил, что обработка реверсином провоцирует высокий уровень анеуплоидии.

Наука зиждется на скептицизме. Один из рецензентов попросил нас придумать альтернативный способ нарушения хромосомного набора и повторить эксперименты с использованием этого нового метода. Это было чересчур и означало, что пройдет еще один год, прежде чем мы сможем опубликовать наши результаты и познакомить с ними других людей. Но когда рецензент говорит вам что-то сделать, вы либо подчиняетесь, либо ваша статья не будет опубликована.

Этот второй метод, использованный Сарой для создания хромосомных аномалий в клетках, основывался на так называемой малой интерферирующей РНК, которую я и моя первая коллега постдок Флоренс Вини применяли в конце 1990-х для включения и выключения генов в определенное время и в определенном месте в мышиных яйцеклетках и эмбрионах [3]. С помощью РНК-интерференции (сокращенно RNAi) можно было целенаправленно снизить уровень экспрессии гена, ответственного за синтез еще одного белка, митотического дефицитного блокатора-2, который задействован в контрольной точке сборки веретена и английское название которого mitotic arrest deficient-2 имеет броскую аббревиатуру MAD2^[18]. Сара провела все эти эксперименты – и вновь после того, как генетический «ключ» был задействован в клеточном «двигателе», на выходе получился тот же результат, хотя воздействие было более тонким, чем при обработке реверсином.

После второй изматывающей серии экспериментов Сара написала статью, которая наконец-то была опубликована в марте 2016 года в журнале Nature Communications [4]. К тому времени Саймону было девять лет. В общей сложности прошло десять лет с того момента, когда я получила аномальные результаты теста, до момента, когда мы смогли поделиться исследованиями мышиных эмбрионов, которые помогли мне разобраться в причинах своих плохих анализов.

Как делается наука

Если коротко, драма научного открытия разыгрывается в трех действиях. Действие первое зависит от новой идеи, придумывания способа ее проверки и, что не менее важно, наличия источника финансирования и подходящих сотрудников. Действие второе включает проведение эксперимента, подтверждающего или опровергающего идею, – чаще всего и то и другое. Действие третье – это подготовка статьи с описанием эксперимента и передача ее в журнал для того, чтобы опубликовать открытие и внести вклад в общую копилку знаний, а также, в зависимости от мнения коллег, повысить их уровень.

Обычно каждое из трех действий требует одинаковых усилий и времени. Зачастую приходится повторять эксперименты снова и снова, чтобы убедиться в полученном результате и глубже понять увиденное.

Успех в науке требует жертв. Для моей команды это означало долгие часы за проведением экспериментов и напряженных дискуссий со мной и друг с другом, чтобы понять смысл полученных результатов. Лично для меня это означало пожертвовать общением с семьей и друзьями и не заниматься другими любимыми делами вроде похода в кино или на художественную выставку. И хотя завершение долгого пути само по себе является наградой, мы обязательно отмечали важное открытие шампанским. В случае исследования мозаичных эмбрионов мы праздновали свои успехи не единожды. Первую вечеринку мы закатили в лаборатории – Сара оказалась не только превосходным ученым, но и кулинаром, и испекла свой особенный торт с фундуком. Вторая вечеринка с Дэвидом и друзьями состоялась у меня дома. Мы танцевали под живую музыку в исполнении группы, которая каким-то образом уместилась в нашем маленьком саду.

Между тем наше исследование породило новые вопросы. В каких случаях аномальные клетки отбраковываются, а в каких – нет? Запускается ли самоубийство какой-то определенной клеточной аномалией? Участвуют ли в этом нормальные клетки? Возможно, в начале жизни эмбриона есть критические периоды, во время которых можно исправить ошибки? Можно ли обнаружить эти контрольные точки и лежащие в их основе механизмы? Используют ли эмбрионы апоптоз после имплантации в матке, чтобы очистить себя от оставшихся аномальных клеток? Когда мы проводили эти эксперименты, для отслеживания судьбы клеток мы могли выращивать эмбрионы только до стадии имплантации. На момент написания этой главы мы пытаемся ответить на некоторые из перечисленных вопросов с помощью более продолжительного культивирования эмбрионов при участии моей нынешней аспирантки Шрути Синглы.

Саймон

Научное исследование вынашивается гораздо дольше, чем любое человеческое дитя. Задолго до того, как эксперименты в моей лаборатории выявили замечательные механизмы самовосстановления эмбриона, устраняющие клетки с хромосомными аномалиями, а также задолго до публикации результатов наших экспериментов с мышами я родила Саймона в больнице Рози в Кембридже. Вновь, как и в случае с Наташей, центр моего эмоционального притяжения был смещен. Ребенок на какое-то время переворачивает жизнь с ног на голову.

К тому времени мы с Дэвидом решили переехать из Грейт-Гренсдена в Кембридж, чтобы не тратить время на дорогу в Наташину школу и обратно в час пик. Последние недели беременности я по полной программе готовилась к переезду, бесконечно упаковывая вещи, совершая звонки и строя планы.

За месяц до родов сделка по продаже нашего прежнего дома провалилась. Однако владелец нового дома сжалился над нами и, несмотря на отсутствие в тот момент денег на оплату, мы заселились в январе, прямо перед моими родами.

Во избежание возможных рисков я решила сделать кесарево сечение. К счастью, я не ошиблась. Принимавший у меня роды врач, Гордон Смит (который позже по чистой случайности станет наблюдающим врачом Хелен Болтон), продемонстрировал нам во время кесарева сечения не один, а целых два узла на пуповине, соединявшей меня с сыном. Если бы я выбрала естественные роды, неизвестно, чем бы это закончилось.

Перед завершением операции ребенка передали мне на руки. Мне не верилось, что этот маленький человечек был моим навсегда. Он был идеальный. Я получила то, за что сражалась долгие месяцы. Несмотря на полученные ранее успокаивающие результаты амниоцентеза, я испытала огромное облегчение, увидев, что мой малыш абсолютно нормальный. Меня охватила такая эйфория, что я согласилась поговорить с дозвонившимся ко мне в больницу журналистом, который интересовался... нет, не Саймоном (о нем знали только друзья и близкие), а нашей статьей о судьбе клеток четырехклеточного эмбриона, которая была опубликована в тот самый день в Nature [5]. Самой не верится, что я тогда ответила на звонок.

В больнице я провела всего одну ночь, в окружении цветов и с новорожденным в люльке рядом с моей кроватью. На следующее утро мне не терпелось забрать его в наш новый дом, к Дэвиду, Наташе и моей маме, которая прилетела по такому случаю из Варшавы. Дома мама сфотографировала меня, держащую кормящегося малыша в одной руке и журнал с нашей статьей – в другой. Теперь я могла наслаждаться одним из счастливейших моментов в моей жизни.

Столько всего предстояло сделать! Надо было купить куклу Наташе, настаивавшей на собственном ребенке. И выбрать имя для нового члена семьи. У нас был целый список, но в итоге мы решили назвать его Саймоном в честь нашего друга, историка Саймона Шамы, мужа Джинни Папайоану, одной из моих ближайших подруг.

Я познакомилась с Саймоном в 2003 году во время поездки в Нью-Йорк, когда мы с Джинни отправились на выставку After Matisse / Picasso («После Матисса / Пикассо») в Музей современного искусства, и Саймон был с ней за компанию. До того дня я не знала, какой он замечательный человек и к тому же знаменитый, являющийся, помимо прочего, автором сценария и ведущим таких документальных сериалов, как A History of Britain («История Британии») и моего любимого Power of Art («Сила искусства»), в котором он описал драматическую историю создания восьми шедевров. Я не верю в магию, но, как выяснилось, имя я выбрала идеальное – мой Саймон тоже очень творческий.

Пока я пишу эти строки, мы все еще живем в Ньюнхэме, и сегодня мой Саймон празднует двенадцатый день рождения. Он чудесный ребенок, и я очень счастлива, что он есть в моей жизни. Он добавил в нее юмор и веселье, свое искусство и, самое главное, всепоглощающий энтузиазм. Он обогатил мою личность во многих отношениях.

Разумеется, я по-прежнему не могу воссоздать все, что происходило внутри меня в течение долгих месяцев до его рождения, но я думаю, что насторожившие меня результаты теста CVS могли быть обусловлены двумя причинами.

Вероятнее всего, тест обнаружил те клетки с хромосомными аномалиями, которые имелись исключительно в плаценте и не затронули Саймона. Вторую причину подсказывает один из моих экспериментов с мышиными химерами: Саймон мог начинать как мозаичный эмбрион, в основном нормальный, но содержащий несколько аномальных клеток. Проведенное вместе с Хелен исследование показало, что, если эмбрион хотя бы наполовину состоит из нормальных клеток, этого достаточно, чтобы исправить проблему и обеспечить нормальное развитие.

В тот счастливый год, когда родился Саймон, наша научная деятельность повернула в новом направлении. Мы опирались на те навыки, которые моя команда оттачивала годами, маркируя, отслеживая и собирая вместе индивидуальные клетки для создания нового вида живого существа: вместо яйцеклеток и сперматозоидов мы использовали разные типы стволовых клеток, чтобы сделать в лабораторных условиях эмбрионоподобную структуру.

Глава 9

Как синтезировать эмбрион

Простой девиз, начертанный на доске в аудитории Калифорнийского технологического института Ричардом Фейнманом, был сфотографирован для будущих поколений. Девиз гласит: «Чего я не могу создать, того я не понимаю».

Эту фразу подхватили биологи, чтобы объяснить, почему для понимания механизмов жизни используется инженерный подход, особенно в синтетической биологии. Если вы можете воспроизвести чудеса природы в лабораторных условиях, тогда вы действительно понимаете, каким образом ей удается провернуть тот или иной трюк. В настоящее время наука перешла от редукционистского молекулярного взгляда к холистическому восприятию всего живого существа [1].

Для нас послание Фейнмана стало актуальным, когда после мозаичных эмбрионов мы решили предпринять следующий логический шаг и создать эмбрионоподобные структуры из стволовых клеток – материнских или базовых клеток, способных дифференцироваться во все типы клеток, составляющие организм.

Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки, которые мой бывший наставник Мартин Эванс изолировал из раннего эмбриона, обладают поистине волшебными свойствами: они могут порождать все типы клеток и создавать любую ткань, но сами по себе не способны вырасти в эмбрион. Нам было интересно узнать причину этого и выяснить, что нужно, чтобы построить эмбрион in vitro, не используя тотипотентную оплодотворенную яйцеклетку.

Клетки, создающие организм и дающие начало ЭС-клеткам, окружены двумя другими типами клеток, которые предоставляют необходимую для выращивания эмбриона информацию, хотя не принимают в этом непосредственного участия: мультипотентные экстра-эмбриональные трофобластные стволовые (ТС) клетки и экстраэмбриональные энтодермные (XEN) стволовые клетки. Следующий вопрос казался очевидным: возможен ли союз этих трех клеточных типов, чтобы они смогли самоорганизоваться и расти по принципам, открытым Аланом Тьюрингом? Если бы нам удалось совершить этот подвиг и создать в лаборатории «синтетические эмбрионы», быть может, мы бы тогда по-настоящему поняли композицию клеточного танца, согласно которому эмбрион строит самого себя.

Эмбриоидные тела

Мечта о выращивании эмбрионоподобных структур в лабораторных условиях не нова. Можно выделить разные ключевые этапы, но, на мой взгляд, серьезный прорыв в создании живых моделей эмбрионального развития был получен благодаря наблюдениям, сделанным в лаборатории Джексона в Бар-Харборе, штат Мэн, которые предоставили первые сведения о «бодибилдерском» потенциале ЭС-клеток. Там в 1950-х Лерой Стивенс обнаружил линию мышей, страдающих спонтанным образованием тестикулярных тератом (тератокарцином) – опухолей, состоящих из смеси эмбриональных и взрослых тканей [2]. Когда Стивенс и его коллега Дон Варнам пересадили образцы тератом в брюшную полость мышей, у тех сформировались целые агрегаты клеток. Несмотря на то что их рост носил бессистемный характер, Стивенс увидел в них некоторое сходство с мышиными эмбрионами в возрасте нескольких дней [3]. Эти структуры, построенные из ЭС-клеток, были названы эмбриоидными телами.

Поскольку такие опухоли состоят из клеток различных тканей, предполагалось, что они вырастают не из зрелых, а из недифференцированных мультипотентных клеток, имеющих близкое сходство с эмбриональными. Их стали называть клетками эмбриональных карцином (ЭК) [4].

На данном этапе ключевую роль сыграл Мартин Эванс. После серии экспериментов в 1970-х, в том числе вместе с Ричардом Гарднером, Мартин показал, что дифференциация этих клеток была вовсе не аномальной (как у злокачественных клеток), а похожей на таковую в эмбрионе. Хотя это означало, что можно изолировать клетки из раннего эмбриона и позволить им расти в лабораторных условиях, на совершение этого подвига потребовалось еще пять лет [5]. В 1980 году Мартин объединился с эмбриологом Мэттом Кауфманом и на следующий год представил в Nature доклад об открытии ЭК-подобных клеток, которые способны вызывать тератомы, а также использоваться для создания химер, продуцирующих функциональные зародышевые клетки; сегодня они известны как ЭС-клетки [6]. В том же году Гейл Мартин из Калифорнийского университета в Сан-Франциско умудрился вырастить ЭК-клетки из эмбриона [7].

В своей фундаментальной статье, опубликованной в Nature, Мартин подчеркнул, что ЭС-клетки можно использовать для генной модификации, а в 1986 году сделал вывод, что эти клетки являются эффективным средством для создания генетически измененных, или трансгенных животных. За это открытие он получил Нобелевскую премию 2007 года. Учитывая пластичность этих клеток для построения всех остальных типов клеток или эмбриональных тканей, кроме внеэмбриональных, казалось разумным предположить, что при выращивании ЭС-клеток в культуре можно воспроизвести развитие эмбриона. Не совсем так. ЭС-клетки способны сформировать эмбриоидные тела, но эти тела не выглядят и не развиваются как эмбрион.

Хотя я много знаю об ЭС-клетках (разумеется, от Мартина), я вдохновилась эмбриоидными телами гораздо позже, благодаря случайной встрече. Когда Саймону было около двух месяцев, мы с Дэвидом взяли его и Наташу в Японию на Окинаву, где Дэвид должен был выступать на конференции. По пути нам пришлось заглянуть в Стэнфордский университет, куда меня пригласил прочитать лекцию мой друг Мэтт Скотт, выдающийся профессор биологии развития, генетик и биоинженер. Во время этого визита я познакомилась с Роэлем Нуссе и его коллегой Дерком тен Бергом, которые любезно поделились со мной своим недавним открытием, связанным с эмбриоидными телами, – они знали, что я отслеживаю процесс создания и нарушения симметрии в эмбрионе. Они выяснили, что эмбриоидные тела могут спонтанно нарушать свою симметрию, в результате чего инициируются паттерны и активируются гены, такие как Brachyury, необходимые для создания мезодермы [8].

Это было потрясающее наблюдение. Тогда я и подумать не могла, что однажды попытаюсь создать эмбрионоподобные структуры, чтобы понять механизмы нарушения симметрии. Лишь годы спустя, вдохновленная нашими результатами, показавшими трансформацию плюрипотентных, неполярных клеток в высокополяризованную розетку на стадии имплантации, я поняла, что мы можем воссоздать этот процесс с помощью ЭС-клеток и построить эмбрионоподобную структуру в нашей лаборатории. Однако мы применили совершенно иной подход.

Как сделать эмбрион

Когда мы наконец-то нашли способ культивирования эмбрионов на стадии имплантации и начали изучать подробности их роста и самоорганизации, мы обнаружили, что это зависит не только от количества клеток, но и от контекста. Под контекстом я подразумеваю хореографию каждого типа клеток и их взаимодействие друг с другом в критическую фазу развития, когда эмбрион впервые увеличивается в размерах и претерпевает метаморфозы. Из работ многих великих биологов, занимавшихся онтогенезом млекопитающих, мы знали, что взаимодействие конкретных клеточных типов имеет решающее значение для нормального развития эмбриона, но точные взаимосвязи и пути, задействованные на этой специфической стадии онтогенеза, оставались для нас загадкой. Культивируя эмбрионы на стадии имплантации in vitro, мы научились распознавать химические и механические сигналы, побуждающие аморфный эпибласт превратиться в розетку из поляризованных клеток. Мы обнаружили, что эта самоорганизация запускается сигналом, в котором участвует внеклеточный матрикс, предоставляемый экстраэмбриональной примитивной энтодермой, и белок бета-интегрин, лежащий на поверхности клеток эпибласта [9]. И мы задались вопросом о том, можно ли сымитировать начало этого процесса у стволовых клеток, если предоставить им правильный контекст.

Наш первый подход был очень простым. Мы взяли клетки только одного типа (ЭС-клетки) и поместили их в трехмерный каркас – гелевую субстанцию матригель, которая содержит материал, в норме предоставляемый примитивной энтодермой. Мы подумали, что это индуцирует поляризацию клеток, которой может оказаться достаточно для запуска клеточной самоорганизации.

Коллега из моей команды, Иван Беджов, занимавшийся этим проектом, увидел, что через тридцать шесть часов культивирования пролиферирующая группа ЭС-клеток и впрямь самоорганизовалась в трехмерную розеткообразную структуру из поляризованных клеток. Эта розетка выглядела точно так же, как та, которую мы наблюдали во время имплантации эмбриона. Затем розетка «эволюционировала» и образовала полость – люмен. Опять же, словно эмбрион, открывающий свою амниотическую полость.

Так мы осознали, что с помощью одних лишь ЭС-клеток можем имитировать первые этапы эмбрионального развития. Несмотря на то что мы использовали только один из трех базовых типов стволовых клеток, присутствующих на заре жизни, нам удалось компенсировать (как минимум частично) отсутствие остальных двух типов подбором правильного количества клеток и правильного окружения из химических соединений, позволяющих клеткам самоорганизовываться.

С помощью нашей первой модели развивающегося эмбриона Иван попытался разобраться в молекулярных сигналах, запускающих формирование проамниотической полости. Когда он использовал ЭС-клетки, лишенные бета-интегрина, они не смогли образовать полость, что указывало на критическую важность передачи сигнала (посредством этого белка) между внеэмбриональными и эмбриональными тканями. Это наглядная демонстрация пользы упрощенных моделей эмбрионов для изучения эмбриогенеза. Наше открытие розетки, механизмов ее формирования в эмбрионе, а также ее имитация при помощи ЭС-клеток были опубликованы в 2014 году в журнале Cell [10].

Но можно ли было воспроизвести следующий шаг развития, тот, что приводит к нарушению симметрии и гаструляции, существенной для формирования всех тканей эмбриона? Те, кто занимается биологией развития, легко ответят на этот вопрос. Вместо использования одних только ЭС-клеток следовало добавить стволовые клетки, формирующие трофэктодерму, из которой образуется плацента, а также стволовые клетки, формирующие примитивную энтодерму, из которой получается желточный мешок. Могли этот рецепт привести к самоорганизации целого эмбриона, ведущей, в свою очередь, к нарушению симметрии?

Наш сумасшедший проект

Тот период совпал с первым годом скитания Сары Харрисон по разным лабораториям, где она выполняла краткосрочные проекты, прежде чем выбрать тему докторской диссертации. Сара подошла ко мне и спросила, могу ли я стать ее научным руководителем. Я с радостью согласилась и попросила ее помочь осуществить мою мечту – создать эмбрионоподобную структуру in vitro из разных типов стволовых клеток. У Сары было полно энтузиазма, сообразительности и амбиций, чтобы взяться за что-то трудное, но значительное. Зная, что прошу многого, я обещала всестороннюю поддержку на протяжении всего ее пути, который, как я подозревала, мог оказаться извилистым.

Под конец первого года работы над диссертацией Сара научилась имитировать с помощью ЭС-клеток первые этапы развития, а именно – поляризацию и люменогенез (Иван к тому времени покинул лабораторию, чтобы собрать собственную команду в Институте Макса Планка в Германии). Затем она продвинулась на шаг дальше и уже наблюдала, как клетки этих структур активируют ген Brachyury, экспрессия которого знаменует нарушение симметрии и обособление мезодермы. И все бы ничего, однако экспрессия Brachyury в ее синтетических эмбрионах была неорганизованной – происходила в случайных местах и совсем не так, как в естественных эмбрионах, у которых экспрессия этого гена всегда происходит между эмбриональной и внеэмбриональной тканями и на одной стороне эмбрионально-внеэмбриональной границы, то есть асимметрично.

Пока мы думали, что же предпринять с первыми результатами Сары, наши соседи из кембриджского отделения генетики во главе с Альфонсо Мартинесом Ариасом опубликовали статью с похожими выводами [11]. Их подход отличался от нашего. Вместо того чтобы начать с небольшого количества ЭС-клеток, формирующих розеточную структуру с открывающейся затем полостью, как у эмбрионов, они начали с сотен ЭС-клеток, создающих эмбриоидное тело, как в оригинальном исследовании Дерка тен Берга и Роэля Нуссе из Стэнфорда [12]. Такой подход тоже индуцировал экспрессию Brachyury, но, как и в нашем эксперименте, без настоящей гаструляции. Хотя методики были разными, итоговый смысл был схож с нашим. Многим исследователям было бы очень обидно наблюдать, как другая команда публикует их исследование. Но только не Саре.