Текст книги "Биологические основы старения и долголетия"

Автор книги: Михаил Виленчик

сообщить о нарушении

Текущая страница: 6 (всего у книги 16 страниц)

Глава III
Механизмы старения и гибели клеток

 И так, теперь мы знаем, что возрастные изменения различных клеток определяются в основном внутренними причинами, хотя об изменении кровоснабжения органов, а также о действии на организм неблагоприятных внешних факторов тоже надо помнить. Что касается последнего обстоятельства, то мы его специально рассмотрим в главе VI. А сейчас для простоты анализа представим, что организм находится в идеальных условиях существования, что старение определяется в основном одним фактором – временем. Различные типы клеток «ощущают» на себе этот фактор по-разному. Одни – независимо от клеточных делений, хотя бы потому, что такие клетки потеряли способность к делению еще до формирования организма. Другие, наоборот, «помнят» о времени по числу совершенных ими клеточных делений в течение почти всей жизни организма.

Теперь мы рассмотрим молекулярные возрастные изменения клеток и постараемся выделить из них наиболее существенные. К числу таких относятся, вероятно, изменения не только ДНК, но и всего белоксинтезирующего аппарата в целом.

Белоксинтезирующие структуры и время

Клетки поджелудочной железы и мышц старых людей и животных продолжают синтезировать соответственно инсулин и миозин, но никогда наоборот. Твердого доказательства существенного изменения в процессе старения специфического для данной клетки «спектра» синтезируемых белков не было получено при исследовании и других органов.

Но такое нарушение, возможно, происходит у раковых клеток, частота возникновения которых возрастает при старении организма. Следовательно, как правило, клетка сохраняет свое дифференцированное состояние (остается "сама собой") до конца своей жизни; и если оно нарушается, то, очевидно, клетка перестает быть нормальной (она превращается в раковую клетку) или гибнет.

Действительно в последние годы обнаружено, что канцерогенез сопровождается и, вероятно, определяется активацией в трансформируемых клетках протоонкогенов. Показано, также, что, во-первых, некоторые из этих протоонкогенов активны только на ранних стадиях развития, и, во-вторых, что дерепрессия протоонкогенов в клетках взрослых организмов может быть связана с их мутацией.

То, что возможности белоксинтезирующего аппарата старых клеток снижены, следует из данных об уменьшении концентрации в них рибосом. Кроме того, синтез белка, проводимый "в пробирке" на рибосомах, выделенных из клеток старых животных, протекает гораздо менее интенсивно, чем на рибосомах, выделенных из клеток молодых животных.

Рассмотрим несколько фактов, поясняющих роль в механизмах старения изменений синтеза белка на уровне трансляции и изменения структуры белка после его синтеза (посттрансляционной модификации).

Так, снижение интенсивности синтеза белка, вероятно, является одним из механизмов старения дрозофилы. Это снижение, в свою очередь, определяется тем, что замедляется процесс роста (элонгации) пептидной цепи, вследствие снижения активности (точнее, синтеза) одного из факторов элонгации. Установлено (Г. С. Вебстер, С. Л. Вебстер, 1985, США), что снижение интенсивности синтеза этого белка связано также с ускорением распада кодирующей его мРНК.

Результаты исследования белоксинтезирующей способности препаратов различных фракций рибосом из тканей молодых и старых мышей показывают, что снижение при старении скорости синтеза белка на уровне трансляции обусловлено внутририбосомными изменениями.

Снижение синтеза белка при старении особенно сильно сказывается на функции головного мозга. Две группы исследователей обнаружили в 1984 году значительное снижение синтеза белка в тканях мозга при старческом склерозе мозга (болезни Альцгеймера). Причем одна группа из Гарвардского университета (США) изучала синтез белка в препаратах, полученных из мозга умерших людей, а другая группа (французских исследователей) определяла метаболическую активность ткани мозга в прижизненных исследованиях.

Связь между снижением функции определенных структур мозга и снижением интенсивности синтеза в них белка была прослежена также в опытах на крысах в лаборатории Л.Соколова (1985, США) и в лаборатории метаболизма мозга отдела охраны здоровья человека в Бетесде. Согласно данным этой лаборатории, опубликованным в 1985 году, особенно значительно снижается синтез белка в старости в структурах, связанных со зрительными и слуховыми функциями (соответственно зрительная кора, верхние бугры; латеральное коленчатое тело; слуховые ядра, нижние бугры и т. д.).

В нескольких лабораториях, в частности в лаборатории Е. С. Северина (Институт молекулярной биологии АН СССР) сделан ряд открытий о ключевой роли протеинкиназ (протеинфосфотрансфераз) в регуляции метаболизма клетки и различных ее функций. Эти ферменты, как видно из их названия, катализирующие процесс фосфорилирования белков, разделяют на два класса: зависимые от циклической аденозинмонофосфорной кислоты (цАМФ) и не зависимые от нее. По данным последних лет, в печени стареющих крыс (исследован возраст до 30 месяцев) активность обоих ферментов понижается. Изменяется даже структура этих ферментов. Так, молекулярная масса казеинкиназы печени 30-месячных крыс больше, чем печени крыс в возрасте 18 месяцев и менее.

Белки всех организмов построены лишь из одной формы аминокислот – L-формы. Однако это твердо установленное правило в процессе старения нарушается. Так, при анализе аминокислот в белом веществе головного мозга трупов людей в возрасте от 30 до 80 лет обнаружено возрастающее с годами содержание D-аспарагиновой кислоты, причем в такой степени, что это может приводить к изменению функции головного мозга.

Синтез различных классов РНК может нарушаться потому, что повреждаются соответствующие матрицы – ДНК. Это особенно относится к тем участкам ДНК, которые служат матрицей для синтеза рРНК. Процесс повреждения таких матриц столь интенсивен, что удалось обнаружить даже уменьшение содержания в клетках головного мозга и сердца старых животных генов, кодирующих рРНК. Такое уменьшение, очевидно, является одной из важных причин снижения при старении способности клетки увеличивать интенсивность синтеза белка в условиях, когда требуется повысить функциональную активность. А это, в свою очередь, является одной из причин снижения "запаса прочности" различных функций у старых организмов (см. предыдущую главу).

Генетический аппарат клеток и старение

Общей для всех стареющих клеток причиной снижения способности к синтезу РНК является повреждение ДНК и образование между нею и ядерными белками прочных комплексов или даже соединений. Этот молекулярный процесс, который мы называем старческой, или инволюционной, репрессией генома (чтобы отличить его от репрессии генома, происходящей при дифференцировке клеток), оказывается, очевидно, центральным событием в старении по крайней мере неделящихся клеток. Нарушение их функций и гибель, в свою очередь, являются определяющими в старении всего организма.

Выше мы рассмотрели подробно только один, хотя и существенный фактор повреждения ДНК в клетке – тепло. Но в процессе метаболизма образуются такие вещества, как кислородные радикалы, перекись водорода, перекиси липидов, формальдегид и целый ряд других веществ, которые активно реагируют с ДНК и тем самым разрушают ее. Кроме того, в клетке (и, как правило, в ее ядре) присутствует фермент дезоксирибонуклеаза, катализирующий деградацию ДНК.

Кислородные радикалы и повреждение генов

Даже жизненно необходимые молекулы кислорода – потенциальный источник повреждения ДНК. Остановимся подробнее на характеристике кислородзависящего процесса повреждения генома.

Прежде всего уточним термин "кислородзависящее повреждение". Для этого вспомним, что окисление органических молекул кислородом в клетках происходит путем катализируемого ферментами переноса электронов (отрываемых от окисляемых молекул) на молекулу О₂. Для полного восстановления молекулы О₂ до 2Н₂О необходимо присоединение к О₂ 4 электронов, так как каждый атом кислорода может присоединить 2 электрона. Однако ферменты переносят электроны на молекулы кислорода по одному. Поэтому в процессе биологического окисления образуются и полувосстановленные формы кислорода, обладающие большой реакционной способностью. Некоторые из таких молекул могут «ускользать» от ферментов, осуществляющих полное восстановление О₂.

Простейшая из таких форм – молекула кислорода, присоединившая 1 электрон и поэтому находящаяся в свободно-радикальном состоянии. Такой анион-радикал называют супероксидным радикалом и обозначают . Например, процесс окисления гипоксантина в ксантин, катализируемый ксантиноксидазой, протекает через восстановление последней и ее реакцией с О₂, в результате чего и образуется .

Известны и другие окислительные реакции (например, аутоокисление катехоламинов), в процессе которых образуется . Такие радикалы участвуют даже в синтезе важных внутриклеточных метаболитов – простагландинов и в осуществлении макрофагами их фагоцитарной функции.

Вырабатывая большие количества , макрофаги убивают поглощаемые ими микроорганизмы, защищая от них организм. Это свидетельствует о том, что минимальная концентрация  является не только неизбежным следствием нормальной жизнедеятельности, но и условием ее поддержания. Но отсюда же видно, и сколь опасны для самой клетки супероксидные радикалы, если в процессе эволюции они были использованы как механизм разрушения других клеток (микробов). Поэтому был выработан и механизм самозащиты, клетки от «своих» радикалов. Его осуществляет фермент супероксиддисмутаза, обезвреживающая .

Но в процессе реакции, катализируемой ею,

образуются молекулы перекиси водорода и кислород в синглетном состоянии – также очень активная форма кислорода. Кроме того, в реакции между  и Н₂О₂, катализируемой ионами железа, образуется химически еще более активная молекула – радикал ОН·.

Все активные формы кислорода: , ^IО₂, ОН· и Н₂О₂ при взаимодействии со структурами клетки повреждают их. Это происходит вследствие переокисления липидов, инактивации белков или повреждения нуклеиновых кислот. Из всех таких реакций важнейшей является повреждение ДНК.

Такое предположение автором этой книги было сделано в 1970 году в другой книге "Молекулярные механизмы старения". Я вспоминаю об этом, потому что гипотезы относительно образования активных форм кислорода и их биологической роли были сформулированы на основании анализа молекулярных механизмов старения. И с начала же 70-х годов количество исследований биологической роли активных форм кислорода стало резко возрастать прежде всего в связи с открытием суперокисиддисмутазы. Существование такого фермента было ясным указанием на то, что супероксидные радикалы образуются в клетке, а их устранение с помощью этого фермента – один из внутриклеточных защитных механизмов.

К заключению о том, что радикал ОН· имеет биологическое значение, мы пришли также на основании анализа молекулярных механизмов летального действия на клетки ионизирующих излучений. Такой анализ показал, что около 50 % "летальных радиационных ударов" обусловлено реакциями, инициируемыми ОН·. Но из данных радиобиологии также следовало, что летальный удар – это повреждение ДНК клетки. Таким образом, исходя из обоих заключений можно было вывести, что по крайней мере радикалы ОН·, индуцируемые излучением, поражают ДНК клетки. Наверное, и образуемые в процессе нормального метаболизма ОН· также представляют для генома реальную опасность. Правда, уж раз мы вспомнили о механизмах радиационного поражения и роли в этих механизмах ОН·, то отметим и то, что эта роль проявляется также и через реакции переокисления липидов с участием ОН·. Но перекиси липидов также повреждают генетический аппарат, и поскольку это один из основных потенциальных эндогенных генотоксических факторов, то по изменению с возрастом содержания их в тканях и сыворотке крови можно судить об изменении степени, так сказать, внутренней угрозы ДНК – при старении. Концентрацию перекисей липидов можно определить довольно простым методом – по реакции с тиобарбитуровой кислотой.

Масоко Хагихара и его сотрудники из института биохимии Нагойского университета обследовали с помощью такого метода две группы (по 60 человек) людей, одну из которых составляли мужчины и женщины моложе 40 лет, а другую – старше 40 лет. В сыворотке крови второй группы содержание перекисей липидов было на 12 % больше, чем в сыворотке крови людей первой группы. Еще более значительным (на 20–25 %) было повышение после 40 лет содержания перекисей липидов во фракциях липопротеидов низкой плотности.

А о роли активных форм кислорода в старении животных организмов свидетельствует недавно обнаруженный факт продления жизни дрозофил путем ограничения их летательной активности, а следовательно, и потребления кислорода. Группа исследователей из США (Р. С. Зохаль с соавторами, 1984) изучили также влияние физической активности дрозофил на активность в их тканях супероксиддисмутазы, катал азы, а также неорганических перекисей и глутатиона. Концентрации последних двух веществ у мух с высоким показателем летательной активности были выше, чем у дрозофил с низкой активностью.

Что касается количественной оценки повреждений ДНК, вызываемых различными эндогенными генотоксическими факторами, то сделать ее трудно из-за того, что их роль и в радиационном, и в спонтанном повреждении ДНК должна резко зависеть от типа клеток и их функционального состояния. Более того, генетический контроль процессов, с протеканием которых связано образование активных форм кислорода и других эндогенных генотоксических факторов, может нарушаться. Как следует из материала, изложенного выше, это должно приводить к увеличению нестабильности ДНК, частоты хромосомных абберраций и увеличению радиочувствительности.

Такая гипотеза была сформулирована и кратко обоснована в статье автора этой книги, опубликованной в 1979 году в журнале "Успехи современной биологии". Практически в ней было предсказано, что существуют генетические заболевания, для которых характерны названные симптомы и в основе которых лежит увеличение количества активных форм кислорода, приводящее к увеличению спонтанной нестабильности ДНК. В последнее время получено доказательство, что такие заболевания действительно встречаются, хотя, к счастью, и редко.

В клетках, вероятно, существует равновесие между активностью супероксиддисмутазы и образованием активных форм кислорода. При старении это соотношение может измениться вследствие не только увеличения продукции супероксида, но и уменьшения активности супероксиддисмутазы, что действительно наблюдается, по крайней мере в некоторых органах.

Другие механизмы и факторы повреждения генетического аппарата клетки

Все рассмотренные нами до сих пор эндогенные генотоксические факторы были неферментативной природы. Но потенциальную опасность для генома клеток представляют ее собственные ферменты.

Основное значение из ферментов такого рода имеют, вероятно, ДНКазы, вызывающие в ДНК разрывы полинуклеотидных цепей.

Идея о том, что ДНКазы не только участвуют в спонтанной деградации ДНК, но что их активация или усиление их синтеза – механизм "программированного" разрушения клеток в процессе старения или морфогенеза, наверное, впервые была сформулирована в докладе-лекции, прочитанной мною в Киеве на IX Международном конгрессе геронтологов в 1972 году. Тогда эта функция ДНКаз была названа механизмом "самоубийства" клетки, (подробнее об этом ферменте будет рассказано в главе IV).

Хотя пока мы обращаем основное внимание на эндогенные генотоксические факторы, а экзогенные (внешние) будут рассмотрены в главе, посвященной проблемам экогеронтологии, о роли одного физического фактора в спонтанной нестабильности ДНК некоторых клеток человека сказать уместно и здесь. Речь идет об УФ-излучении солнечного света и о клетках участков кожи, не защищенных одеждой или волосяным покровом.

Для таких клеток роль естественного УФ-излучения в нестабильности их генетического вещества сравнима с ролью тепла в его спонтанной нестабильности. Так, сопоставляя результаты расчетов интенсивности достигающего клеток кожи человека УФ-излучения солнечного света в Южных широтах Северного полушария с зависимостью количества образуемых димеров пиримидиновых оснований от дозы УФ-облучения, определенной экспериментально на культивируемых клетках человека, можно заключить: в ДНК каждой клетки человека с белой кожей, в течение часа пребывающего на ярком солнце, образуется примерно 5·10⁴ повреждений, представляющих собой пиримидиновые димеры (т. е. ковалентно сшитые друг с другом пиримидиновые основания, расположенные рядом в одной из полинуклеотидных цепей). Большая часть из них удаляется (вырезается) из ДНК с помощью эксцизионной системы ее репарации.

Но возвратимся к проблеме спонтанных повреждении ДНК. Очевидно, что для понимания молекулярных механизмов старения принципиальное значение имеет вопрос о том, как изменяются с возрастом два рассмотренных фундаментальных, диалектически противоположных процесса возникновение спонтанных повреждений и их репарация. Результаты нескольких исследований (подробнее о них будет рассказано в главе IV) позволяют полагать, что эффективность процесса репарации в старых клетках может быть меньше, чем в молодых. Кроме того, есть основания считать, что нарушение слаженности в работе ансамбля репарирующих ферментов приводит не к залечиванию, а наоборот, к интенсивному повреждению ДНК. Ведь мы видели (см. рис. 6), что на определенном этапе должно происходить своевременное переключение процесса репарации с этапа выщепления оснований на этап синтеза ДНК – заполнения имеющейся в ней бреши. Если же такое переключение почему-то задерживается (например, в клетке понижена концентрация ДНК-полимер азы), и в этом случае экзонуклеаза не может "вовремя остановиться", то процесс деградации ДНК должен стать не физиологическим, а патологическим – процесс репарации "переходит" в свою противоположность, т. е. развивается повреждение генома.

Таким образом, накопление повреждений в геноме стареющих клеток происходит не только вследствие нарушения равновесия между процессами возникновения спонтанных повреждений ДНК и их репарации, но и потому, что уменьшается репарируемость повреждений.

Для того чтобы повреждение могло быть репарировано, оно должно быть доступно для действия репарирующих ферментов. Но ДНК в хроматине ядра находится в упакованном состоянии. Возникающие в некоторых участках генома повреждения ДНК с трудом могут быть "найдены" ферментами репарации. Это особенно относится к тем участкам генома, которые обычно неактивны, синтез РНК на которых не происходит. Если облучить клетку ультрафиолетовым излучением и определить скорость репарации повреждений ДНК, индуцированных этим излучением, то оказывается, что именно в таких участках повреждения ДНК остаются длительное время невосстановленными. Казалось бы, поскольку эти гены функционально неактивны, то и накопление в них повреждений безразлично для клетки. Однако так обстоит дело только до определенной поры. Если клетка вступает в фазу деления, то на таких "испорченных" матрицах будет синтезироваться ДНК с неправильной последовательностью оснований или ДНК, вовсе не содержащая оснований в участке, комплементарном "испорченной матрице". Если в результате повреждений ДНК произойдет нарушение синтеза и распределения между дочерними клетками той пары хромосом, в состав которой такая ДНК входит, клетки могут погибнуть.

Повреждения, возникающие в функционально инертных генах, должны "проявиться" также в тех случаях, когда возникает потребность в их активации, например при гормональной и субстратной индукции синтеза белка и при синтезе антител в ответ на поступление в организм чужеродных антигенов. Во всех этих случаях синтезируемые на "испорченных" матрицах ДНК могут быть функционально неактивными или направлять синтез мутантных белков. Следовательно, рассмотренный процесс накопления повреждений ДНК в тех генах, которые вследствие относительно прочной связи с белками репрессированы (временно или постоянно) и малодоступны для репарации, очевидно, является важной причиной снижения способности старых клеток к индукции синтеза ферментов и антител. Но ведь ранее мы пришли к заключению, что такого рода возрастные изменения определяют уменьшение функциональной способности различных органов, являются характерным признаком старения всего организма. Значит, теперь мы можем определить уровни старения и связи между ними – от молекул до организма.

Существует еще одно обстоятельство, которое делает весьма опасным длительное сохранение в клетках повреждений ДНК. Участки ДНК, содержащие изменения в структуре, вызванные различными повреждающими воздействиями (будь то тепло, ионизирующее или ультрафиолетовые излучения или химические вещества), обладают повышенным "сродством" не только к ферментам, участвующим в репарации этих повреждений, но и к другим белкам. Причем в последнем случае может образоваться химическая, связь (сшивка) между модифицированным участком ДНК и белком (см. рис. 1). После этого клетке труднее провести репарацию ДНК. Более того, такая сшивка ДНК – белок может быть нерепарируемой вообще, что означает необратимое нарушение или, скорее, выключение функции гена.

Ведь независимо от того, в каком синтезе участвует этот ген – в синтезе ДНК или РНК, для обоих этих процессов необходимо, чтобы ферменты, их катализирующие (соответственно ДНК– и РНК-полимераза), продвигались, "скользили" вдоль матрицы. Когда ферменты достигнут участков ДНК, содержащих сшивки ДНК с белком, весьма вероятно, что их продвижение будет остановлено, и, следовательно, редупликация гена, или его транскрипция, окажется незавершенной. Рассмотренный механизм выключения функции гена мы и называем инволюционной репрессией.

В предыдущем издании этой книги автор мог привести лишь один результат изучения изменений ДНК клеток в процессе их старения. Как же продвинулось исследование этого вопроса за прошедшие 11 лет?

Прежде всего обратим внимание на то, что в результате того или иного воздействия на ДНК в ней могут возникать самые различные повреждения, причем в самых различных количествах. Естественно, это очень затрудняет изучение изменений ДНК при старении. Ведь большинство типов повреждений, очевидно, даже к старческому возрасту накапливается в геноме в очень малых относительных количествах (по сравнению с чувствительностью даже самых совершенных методов анализа структуры ДНК). Поэтому, чтобы определить характер повреждений ДНК, возникающих и накапливаемых в геноме клеток при их старении, необходимо теоретически предвидеть наиболее существенные из этих типов повреждений. Об одном способе такого предвидения мы уже рассказали – он состоит в анализе биофизических свойств ДНК и механизмов ее спонтанной (тепловой) нестабильности.

Другой путь – проанализировать характер повреждений ДНК, индуцируемых ионизирующим излучением или химическими веществами, и попытаться определить общие механизмы возникновения этих повреждений. Если есть теоретические основания полагать, что такие механизмы "работают" и в неповрежденной клетке, то можно ожидать, что и в процессе старения с относительно большой вероятностью можно обнаружить накопление повреждений ДНК сходного типа.

Один из наиболее изученных продуктов, образуемых в ДНК после облучения клеток ионизирующей радиацией или в результате воздействия на нее химическими мутагенами, – это гликоль тимина или тимидина. Такие продукты образуются в результате окислительной деструкции ДНК. Но различные вещества (ОН·, , Н₂О₂ и т. д.), способные индуцировать процесс окислительной деструкции ДНК, образуются и в процессе нормального метаболизма. Следовательно, можно было ожидать, что такие продукты возникают и в ДНК необлученной клетки. Косвенно об этом свидетельствует выделение этих продуктов с мочой. Так, по данным, полученным методом хроматографии, ежесуточно каждый человек выделяет с мочой в среднем около 32 нМ этих продуктов. У экспериментальных крыс выделение гликоля тимина или тимидина в 15 раз более интенсивно, чем у человека (если пересчитать количество этих продуктов на 1 кг массы тела).

Максимальная (видовая) продолжительность жизни человека, по мнению многих исследователей, составляет примерно 100 лет. У лабораторных крыс она варьирует в зависимости от линии и достигает 4 лет. Иными словами, человек примерно в 25 раз долговечнее, чем крыса. Таким образом, между интенсивностью выделения гликоля тимина и продолжительностью жизни, возможно, существует обратно пропорциональная зависимость.

Модифицированные нуклеотиды или основания сначала выделяются во внутриклеточное пространство в процессе репарации ДНК с помощью ферментов, вырезающих поврежденные участки ДНК. Лишь затем они или продукты их метаболизма выводятся сначала из клетки, а потом и из организма. Но отсюда следует, что, чем больше выводится этих продуктов с мочой, тем больше их образуется и из ДНК клетки. Стало быть, открывается возможность на основании анализа продуктов метаболизма ДНК в моче делать хотя бы косвенные заключения об интенсивности химической модификации ДНК в клетках и роли таких модификаций в развитии различных болезней (особенно опухолей) и в старении.

Накопление в ДНК клеток человека повреждений первичной структуры

Теперь я расскажу подробнее о результатах исследований, проведенных нами на культивируемых клетках человека. Повреждения ДНК клеток человека были исследованы при старении этих клеток в организме (in vivo), а также вне организма (in vitro). Кроме того, такие повреждения ДНК были сопоставлены с повреждениями ДНК, возникающими при не очень интенсивном прогревании клеток или облучении их ионизирующим излучением. Рассказывая о наших данных, я познакомлю любознательного читателя с некоторыми особенностями изучения повреждений ДНК «щадящим» методом.

Один из основных методов анализа ДНК, использованных нами при исследовании этих вопросов, – метод седиментации ДНК в градиенте щелочной сахарозы. Этот метод уже упоминался (см. с. 27). Мы сразу перейдем к рассмотрению полученных вместе с А. Н. Хохловым данных, делая пояснения методики при изложении результатов.

На рис. 8 представлены седиментограммы ДНК эмбриональных фибробластов и фибробластов, полученных из кожи 91-летнего донора. На графике указано, какой процент ДНК от общей массы ДНК (содержавшейся в клетках, нанесенных на градиент) был в той или иной из фракций (частей), на которые разделяли содержимое центрифужной пробирки после окончания центрифугирования. 1-я фракция соответствовала дну пробирки, 15-я – верху градиента. Это означает, что высокомолекулярные фракции ДНК – первые, низкомолекулярные – последние номера фракций. И следовательно, чем больше седиментограмма сдвинута вправо, тем меньше среднее значение молекулярной массы ДНК, тем больше в ней было разрывов.

Рис. 8. Профили седиментации ДНК диплоидных фибробластов медицинского абортуса (1) и фибробластов кожи 91-летней женщины (2). Цифры на рисунке – средние значения молекулярных масс ДНК соответствующих клеток

На графике приведены также значения средневесовых молекулярных масс, рассчитанных с помощью ДНК фага λb₂. Молекулярная масса этой ДНК известна, а положение ее в градиенте, использованном при исследовании клеток человека, позволяло рассчитать массу их ДНК.

Очевидно, нелишней будет такая подробность. Штаммы эмбриональных фибробластов были получены из Института медицинской генетики АМН СССР. Предварительно они были исследованы там К. Н. Гринбергом, и хромосомных изменений в них не было найдено, т. е. это были нормальные клетки, хотя получены они были из тканей при аборте. Культуры "взрослых" и "старых" фибробластов получены безболезненным и безвредным методом биопсии с передней поверхности кожи предплечья здоровых доноров, пожелавших, чтобы их клетки были обследованы. (Здесь я опять должен с благодарностью вспомнить о большой помощи со стороны К. Н. Гринберга и Г. Д. Бердышева.) Клетки кожи 91-летней женщины к нам попали из Института геронтологии АМН СССР (Киев), где эта пациентка находилась на обследовании (и у нее не было найдено резких патологических изменений).

Опыты с клетками каждого человека нужно было повторять многократно, поэтому приходилось все культуры пересевать. Исследовались культуры, которые еще не вступили в фазу дегенерации (вспомним, что эмбриональные диплоидные фибробласты человека совершают в культуре клеток около 50 делений, взрослые фибробласты даже меньше).

Для устранения осложнений, связанных с возможным образованием разрывов в фазе репликации ДНК, использовали только культуры клеток, находящиеся в состоянии сомкнутого монослоя, когда вследствие контактного торможения митотическая активность клеток прекращалась. Кроме того, чтобы исключить образование в ДНК таких разрывов, за 24 часа до снятия клеток со стекла среду их роста заменяли на свежую, не содержащую меченого тимидина. Далее клетки наслаивали на 5-20 %-ный градиент сахарозы, содержащий также другие вещества в определенных количествах, специально подобранные, чтобы избежать артефактов при центрифугировании ДНК.

Как видно из рис. 8, седиментограмма ДНК "старых" фибробластов сдвинута вправо по сравнению с седиментограммой ДНК эмбриональных фибробластов, а среднее значение массы первой меньше массы второй. Эти результаты можно с большой вероятностью интерпретировать как доказательство накопления с возрастом в ДНК однонитевых разрывов и щелочелабильных связей (апуриновых участков, алкилированных фосфатных групп и т. д.).

Изменения ДНК в клетках, полученных от старых людей, а также в клетках культур последних пассажей не были для нас неожиданными. Однако теоретически непредсказуемый результат был получен при сравнении ДНК диплоидных фибробластов эмбрионального происхождения и ДНК фибробластов, полученных из кожи молодых здоровых доноров (в возрасте 25–30 лет).

Эти данные позволяют утверждать, что в клетках ДНК человека начинается накопление щелочелабильных связей, когда организм еще молод. Особенностью диплоидных фибробластов является то, что их митотический потенциал уменьшается начиная с периода эмбрионального развития. И если такое уменьшение принять за общий критерий старения клеток, то получается, что диплоидные фибробласты начинают "стареть", вероятно, еще до того, как закончился период эмбрионального развития организма. Возможно, тогда же начинается и накопление спонтанно возникающих повреждений ДНК.