Текст книги "Пять нерешенных проблем науки"

Автор книги: Артур Уиггинс

Соавторы: Чарлз Уинн
сообщить о нарушении

Текущая страница: 7 (всего у книги 18 страниц)

Е. coli и другие организмы

Е. coli – одно из наиболее изученных живых существ; исследователи выявили примерно две трети функций ее генов. Механизм задействования lac-оперона составляет лишь малую часть молекулярных отправлений Е. coli. Возможно, вас удивит, почему столь много внимания уделяется этой крохотной бактерии, настолько маленькой, что 50 таких созданий уместится на кончике человеческого волоса.

Все дело в том, что значительно проще проводить биологические исследования без привлечения людей, к тому же при этом не возникают этические вопросы. Простые организмы проще и быстрее выращивать, и это относится к проведению самих опытов. По размерам Е. coli – весьма подходящий объект для исследований, к тому же она поразительно быстро размножается: делится каждые 20 минут. При достаточном количестве воды, глюкозы (или лактозы) и места за десять часов из одной Е. coli можно получить свыше 1 млрд. клеток. Если другие штаммы Е. coli опасны для здоровья, то разновидность К-12 вполне безобидна, так что нет нужды предпринимать серьезные меры предосторожности.

Вот уже свыше 70 лет Е. coli выступает рабочей лошадкой биохимии, генетики и биологии развития. Сходство ее молекулярного процессинга с происходящим в других организмах даже привело к использованию ее в качестве фабрики по производству инсулина для больных диабетом. Жак Моно, выдающийся французский ученый и Нобелевский лауреат 1965 года, однажды заметил: «Что верно для Е. coli, верно и для слона».

Изучаются и другие прокариоты, вроде Mycoplasma genitalium [возбудителя мочеполового микоплазмоза], самого крохотного самостоятельного живого организма, в составе ДНК которого 580 тыс. пар азотистых оснований и 517 генов, и Haemophilus influenzae [палочки Пфайфера, возбудителя пневмонии и гнойного менингита], в составе ДНК которого 1 830 137 пар азотистых оснований и 1743 гена. Но относительная простота прокариотной ДНК в связи с ее величиной и кольцевидностью ограничивает ее применение к более сложным организмам.

От прокариот к эукариотам

Жизнь у прокариот хлопотная. Эти проворные маленькие существа должны обладать отменной реакцией. Как только появляется пища, они должны ее переварить, чтобы успеть вырасти. Система управления наподобие lас-оперона хорошо приспособлена к быстрым действиям, когда нужно установить требуемый уровень ферментов в соответствии с быстро меняющейся средой.

Положение с эукариотами совершенно иное. Большинство многоклеточных организмов развивалось таким образом, что их внутренние клетки оказались отрезанными от меняющейся внешней среды. Стабильная внутренняя обстановка – гомеостаз – необходима для надежной работы многоклеточных организмов. В итоге генные механизмы управления у эукариот оказались в большей степени рассчитаны на регуляцию организма в целом.

Например, некоторые гены активируются лишь однажды и вызывают необратимые действия по сравнению с полностью обратимым механизмом lac-оперона. У многих животных неспециализированные, так называемые стволовые клетки развиваются очень рано, еще у зародыша. Они превращаются в специализированные клетки, вроде клеток мозга или ногтей, следуя определенному генетическому образцу, который может в итоге привести даже к смерти клетки. Такая специализация клеток порождает все большее число ДНК, РНК и белковых ферментов, так что эукариоты могут совмещать в своем метаболизме тонкие взаимодействия между этими молекулами.

Модельные организмы

Излюбленный объект исследования среди эукариот – Saccharomyces accharomyces cerevisae (S. cerevisae) больше известный как пивные дрожжи. Пожалуй, это более всего изученный на молекулярном и клеточном уровнях эукариотный организм. S. cerevisae представляет собой всего лишь одноклеточный грибок, но многие процессы в его клеточном ядре сходны с теми же процессами у млекопитающих. Действительно, исследование дрожжей помогло выявить многие молекулы и химические реакции, задействованные в процессах, ход которых нарушается при раке. S. cerevisae устроены сложнее бактерии, чье ДНК, содержащее около 12 млн. нуклеотидных пар азотистых основания, имеет 6 тыс. генов. И Е. coli, и S. cerevisae считаются модельными организмами, которые должны:

1) быстро развиваться, имея короткий срок жизни;

2) обладать малыми размерами, будучи взрослыми;

3) быть всегда под рукой;

4) быть простыми в обращении;

5) выполнять свои биологические функции сходным с более сложными организмами, вроде человека, образом.

Усердно изучаются и другие модельные организмы. Caenorhabditis elegans – прозрачный круглый червь, вырастающий в длину не более 1 мм, вполовину величины вот этого знака ~. С. elegans достигает взрослого состояния за три дня, живет в почве по всему свету и питается микробами вроде тех, что обитают в перегное.

Этот маленький червь представляет собой многоклеточную (959 клеток) эукариоту с 19 099 генами в состоящей из 97 млн. пар азотистых оснований ДНК. Он развивается из одной клетки в организм с нервной системой и «мозгом». С. elegans способен к обучению, вырабатывает яйцеклетки и сперматозоиды, постепенно стареет и умирает. Сидни Бреннер, молекулярный биолог из Великобритании, говорит, что С. elegans оправдывает свое название, ибо на самом деле «фотогеничен», как видно на рис. 4.5. Бреннер, Джон Салстон и Роберт Хорвиц разделили Нобелевскую премию 2002 года по физиологии и медицине как раз за работу с червем С. elegans.

Другой модельный организм, Drosophila melanogaster, знаком многим из нас. В 1906 году гарвардский профессор эмбриологии Уильям Эрнест Касл привлек к участию в одном проекте аспиранта [Крейга Вудворта].

Рис. 4.5. С. elegans

Он попросил его не убирать несколько перезрелых виноградин, а затем посмотреть, что получится. Получились D. melanogaster – плодовые мушки – организм, изучаемый ныне в лабораториях по всему миру. Благодаря своим идеальным свойствам модельного организма плодовые мушки широко используются в исследованиях по генетике и биологии развития.

Жизненный цикл плодовой мушки составляет 16 дней, а новое поколение она дает каждые 12 часов. Эти существа плодовиты, непритязательны и, по словам генетика из Беркли Герри Рубин, имеют столь много общего с человеком, что их называют крохотными людьми с крыльями. Црозофила располагает 13 600 генами на ДНК из 165 млн. нуклеотидных пар азотистых оснований. Весь этот молекулярный аппарат умещается в тельце длиной 3 мм, величиной примерно с букву V в имени Venter (о самом Вентере чуть позже).

Mus mesculus (мышь), давний любимец медиков, занимающихся изучением болезней и лекарств, тоже соответствует всем требованиям, предъявляемым к модельным организмам. К тому же геном мыши весьма схож с геномом человека.

Генетические сравнительные исследования уже многое прояснили в отношении строения и функционирования человеческого тела. Дальнейшие исследования принесут дополнительные сведения.

Другие создания, вроде полосатой перцины, иглобрюха [родственного горчице сорняка из семейства крестоцветных], резушки Таля (Arabidopsis thaliana) и палочки Пфайфера (Haemophilus influenzae), выступают в роли модельных организмов и изучены в разной степени. Модельные организмы и приспособления, требуемые для их изучения, вызывают в памяти ситуации из классической описательной биологии с образами бесчисленных исследователей, склонившихся над микроскопом или щурящихся сквозь стекла очков во время поездок по экзотическим местам, где можно увидеть организмы в их естественной среде обитания (вспомним Чарльза Дарвина на Галапагосских островах).

Физика – биология – химия

Несмотря на значимость модельных организмов для биологов, поле деятельности современной биологии значительно расширилось во многом благодаря нахлынувшим туда представителям других отраслей знаний, чья деятельность преобразила сам подход к изучению биологии.

Чтобы понять, как произошло это преображение, взглянем иначе и шире на центральное учение молекулярной биологии. Описательная биология сосредоточивалась на видимых признаках, но находила мало объяснений, связанных с этими признаками молекулярных механизмов. Затем пришел черед химии, занимавшейся химическими реакциями внутри живых существ, прояснявшими биологические процессы. Но главная трудность состояла в том, что управляющие живыми системами молекулы были слишком малы, чтобы их можно было для разглядывать в микроскоп.

Следующими нахлынули физики, посредством рентгеновской кристаллографии выявившие двойную спираль ДНК (вспомним биолога Джеймса Уотсона и физика Фрэнсиса Крика, воспользовавшихся данными рентгеновского кристаллографа Розалинды Франклин). Итак, хорошие вести заключались в создании представления об общем строении ДНК, а плохие – в невозможности разглядеть подробности ее строения из-за малых размеров. ДНК содержит такое огромное количество парных оснований нуклеотидов, что их определение и выписывание оказалось сложной задачей.

Итак, положение биологии в 198 0-е годы было следующим: молекулярная биология сосредоточилась на работе с крайне малыми объектами; классическая описательная биология ограничилась наблюдением той части биосферы, которая была доступна зрению, пусть и сквозь окуляр микроскопа. Многие детали на стыке микро – и макроскопических областей биологии оказались совершенно необъяснимыми (рис. 4.6).

Рис. 4.6. Общая картина биологии

Переход от большого масштаба к малому происходил медленно. Изучение молекул с химической точки зрения кое-что проясняло, но продвижение шло черепашьим шагом, а черепаха, увы, не модельный организм.

В середине 1980-х годов некоторых биологов осенило: почему бы не изучить весь состав ДНК живого организма, так называемый геном? Более того, посредством отдельных модельных организмов прийти к конечной цели – геному человека. Это привело к очередному наплыву в биологию приборостроителей, программистов, предпринимателей и появлению одного неуемного исследователя – Дж. Крейга Вентера.

Составление карты генома человека. Великие задачи требуют величественныхорудий

Прежде чем описывать все перипетии, увенчавшиеся в итоге составлением карты генома модельных организмов и человека, вникнем в подробности того, как устанавливается последовательность оснований плотно упакованной молекулы ДНК. Оказывается, геном человека состоит из 3 млрд. парных оснований нуклеотидов. Если считать их по одному в секунду, на это уйдет почти 100 лет. Очевидно, для их определения потребовался более быстрый способ, для чего понадобилось усовершенствовать несколько методов.

Электрофорез.

В 1937 году шведский биохимик Арне Тиселиус (Тизелиус) разработал метод разделения заряженных частиц во взвеси на основе их массы и заряда (рис. 4.7). Заряженная частица в электрическом поле под действием его силы ускоренно движется в сторону противоположно заряженного электрода. Погруженная в среду (гель) частица тормозится под действием силы трения. При равенстве электрической силы и силы трения частица движется с постоянной скоростью, именуемой конечной. Данный подход знаком парашютистам, которые благодаря уравновешиванию их веса с силой трения опускаются на землю с постоянной, а не с возрастающей скоростью.

Рис. 4.7. Установка для электрофореза

Для выделения частиц в геле Тиселиус применил красители. Данный подход он впервые опробовал при разделении белков в растворе – а в 1948 году был удостоен за свою работу Нобелевской премии по химии. С тех пор его метод использовался в опытах с множеством частиц при движении в различных средах. А для их выделения существуют несколько различных приемов.

Рестрикционные ферменты.

Создание рестрикционных ферментов началось весьма необычно: в опытах с бактериофагами. Бактериофаги (или фаги) представляют собой вирусы, атакующие клетки бактерий, внедряя свои ДНК в клетку-хозяина, который затем плодит данный вирус. Фагов независимо друг от друга открыли в 1917 году бактериологи Фредерик Туорт из Великобритании и Феликс д'Эрелль из Франции. Опыты на бактериофагах получали все больший размах благодаря их возможности убивать опасные для человека бактерии. Однако интерес к ним упал после открытия пенициллина и других химических антибиотиков.

Бактериофаги столь многочисленны (по оценкам, их количество составляет 10 30), что их общая биомасса значительно превышает общий вес населения Земли.

Рис. 4.8. Бактериофаг. Хвостовые нити

Они почти целиком состоят из белков и ДНК (рис. 4.8). Будучи вирусами, они не могут жить без хозяина. Ввиду простоты своего устройства они оказываются идеальными испытуемыми для получения сведений о жизнедеятельности и их самих, и их хозяев.

Хамилтон Смит, микробиолог из университета Джонса Хопкинса [9]9
  Хопкинс Джонс (1795–1873) – американский квакер, финансист, филантроп. Сделал состояние на оптовой торговле продуктами питания, банковском деле, железные дорогах. Завещал около 7 млн. долларов на создание университета и медицинского центра в г. Балтиморе, штат Мэриленд, названные его именем: Johns Hopkins University, Johns Hopkins Hospital.


[Закрыть]в конце 1960-х работал с Haemophilus influenzae Rd и фагом Р22. Случайно бактерии и фаги стали выращивать вместе. Смит заметил, как активность ДНК у фага все время падала, что указывало на расщепление ДНК фага чем-то внутри бактерии. Смит со своими сотрудниками выделил и очистил ответственный за расщепление фермент и установил его механизм: белковый фермент внутри Н. influenzae расщепляет ДНК фага, выявляя определенную цепь из шести парных оснований и расщепляя ДНК – неизменно в одном и том же месте и одним и тем же способом. Такой фермент получил название рестрикционного. Помимо этого фермента Н. influenzae Rd располагает еще одним ферментом, четилазой, защищающей ДНК бактерии от подобной участи. Фермент метилаза присоединяет метиловую группу к нуклеотидным основаниям цитозина или аденина в ДНК бактерии. Метилирование настолько изменяет молекулу ДНК, чтобы рестрикционный фермент все еще мог распознать место своего подсоединения, не вмешиваясь при этом в обычный ход воспроизводства или метаболизма самой бактерии.

С тех пор удалось открыть тысячи ферментов, расщепляющих ДНК на определенных участках. Отрыты были и ферменты, скрепляющие вместе куски ДНК. В итоге всех этих открытий молекулярные биологи располагают ныне набором белковых ферментов, позволяющих им разрезать или склеивать ДНК в заданных местах.

Сенгеровский метод обрыва цепи [замещающим нуклеотид] дидезокси [рибонуклеозидтрифосфатом] для секвенирования ДНК.

В 1977 году биохимик из Великобритании Фред Сенгер разработал способ расщепления ДНК на участки, соответствующие любой длине исходной ДНК. Этот метод использовал замещающую нуклеотид молекулу. Заместитель не образует связи со следующим нуклеотидом в последовательности, необходимой для создания всей ДНК, так что цепь обрывается на нем.

Приведем пример. На рис. 4.9 верхняя молекула имеет атом кислорода, связанный с атомом водорода в положении 3 (атомы углерода в кольце нумеруются цифрами 1 , 2 , 3 , 4 и 5 ), тогда как у атома водорода в положении 4 атом кислорода отсутствует (отсюда приставка дезокси-). У нижней молекулы атом водорода отсутствует на позициях 3 и 4 , поэтому ее название начинается с приставки диде-зокси-. Из-за такой разницы в строении, когда при сборке молекулы ДНК в нее встраивается дидезоксидное основание, она уже не связывается с другим нуклеотидным основанием (в позиции 5 ), и цепь ДНК обрывается в этом месте. То же происходит с другими основаниями ДНК (аденином, гуанином и цитозином). В итоге можно получать ДНК различной длины (на изображениях молекул пустые углы на кольцах соответствуют атомам углерода).

Рис. 4.9. Дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) и дидезокситимидинтрифосфат (ддТТФ)

Сенгеровский метод обрыва цепи дидезоксидными основаниями для секвенирования ДНК начинается с того, что посредством рестрикционных ферментов расщепляют подвергаемую секвенированию ДНК на меньшие участки, а ДНК нагревают до полного разделения обеих ее нитей. Затем к этим однонитевым участкам ДНК добавляют трифосфаты с дидезоксидным основанием, после чего вводится белковый фермент ДНК полимераза, который приступает к сборке копий исходной ДНК. Из-за дидезоксидных оснований собранные молекулы представляют собой не копии исходной ДНК, а смесь из полученных прежде участков ДНК. Предварительно дидезоксидные основания помечаются (маркируются) либо радиоактивным изотопом фосфора, либо чувствительным к ультрафиолетовому свету красителем, так что конец каждой оборванной цепи становится видимым.

Затем эту смесь цепей ДНК помещают в лунки пластины геля и дают электрическое напряжение. Более короткие участки испытывают меньшее сопротивление среды (обычно желе из водоросли агароза, схожее с желатином «Джелло» [10]10
  «Джелю» (Jell-O) – полуфабрикаты желе и муссов, выпускаемые в порошке крупнейшим в США производителем пищевых продуктов Kraft Foods Inc., дочерней компанией Philip Morris Cos.


[Закрыть]вещество, с той лишь разницей, что молекулы там образуют дополнительные связи, делая гель прочным) и поэтому движутся быстрее. Часто в качестве образца в одну из лунок помещают цепи известной длины. После достижения наиболее короткими цепями края пластины геля напряжение снимают. По радиоактивным или флуоресцентным маркерам определяют нуклеотидное основание в конце каждой молекулярной цепи. Поскольку электрофорез распределяет молекулы в соответствии с возрастанием длины цепи, при просмотре виден порядок расположения парных оснований нуклеотидов в исходной ДНК.

Данный метод широко применялся до середины 1980-х годов, и работа над диссертацией у многих аспирантов заканчивались участием в многолетнем проекте по секвенированию определенной части ДНК одного из модельных организмов. Приходилось брать пробы у организма, очищать, смешивать с химическими реактивами, выращивать, помещать в гель и проводить исследование, после чего собирать и толковать данные. Работа была тяжелой и продвигалась медленно. Обычно в ходе написания диссертации удавалось выстроить участок в 40 тыс. парных оснований ДНК.

Секвенирование генома человека

Озвучивая мнения многих влиятельных биологов, в номере Science за 7 марта 1986 года Ренато Дульбекко, глава Института биологических исследований им. Солка, [11]11
  Солк Джонас Эдвардc (1914–1995) – американский иммунолог. Первым разработал противополиомиелитную вакцину на основе инактивированного формалином вируса, выращенного на клетках обезьяньей почки, так называемую инактивированную полиовакцину (ИПВ), которая с 1954 года широко применялась в США, а также противогриппозную вакцину с двухгодичным сроком действия. В 1963 году основал в пригороде Сан-Диего (штат Калифорния) Институт биологических исследований, названный его именем.


[Закрыть]призвал к претворению в жизнь грандиозной программы по расшифровке генома человека. Он доказывал, что столь огромные усилия необходимы для понимания роли генов в развитии рака. Некоторые биологи, вроде Уолтера Гилберта (известного гипотезой РНК – мира), с радостью восприняли это предложение. Гилберт сказал: «Полный геном человека – Грааль генетики человека» (подробнее об этом сравнении далее).

Другие выразили озабоченность, что подобный гигантский проект исказит биологию до неузнаваемости. Расшифровка 3 млрд. пар азотистых оснований с помощью имеющихся на тот час средств потребует 15 – летней непрерывной работы 10 тыс. аспирантов и обойдется примерно в 3 млрд. долларов. При таких затратах человеческих и денежных ресурсов ничего не останется на все остальные биологические проекты.

Луч надежды блеснул с появлением автоматизированных устройств секвенирования. Центр исследования человеческого генома [ныне Национальный институт генома человека], подразделение [сети институтов, объединенных общим названием] Национального института здоровья (НИЗ), официально приступил к работе в октябре 1990 года под руководством Джеймса Уотсона – да, самого Джеймса Уотсона. Данный проект задумывался как международный: большинство работ поручалось различным государственным лабораториям и университетам в США, и около трети приходилось на долю Великобритании, Франции, Германии и Японии.

Все усилия были сосредоточены на создании устройств автоматизированного секвенирования, что привело к наплыву в биологию приборостроителей. В конце 1986 года биохимик, доктор медицины Лерой Худ и биохимик – технолог Майкл Ханкапиллер создали компанию Applied Biosystems Inc. (ABI) и разработали устройство, способное секвенировать в день 12 тыс. парных оснований нуклеотидов. В начале 1987 года лаборатория молекулярной биологии, возглавляемая Дж. Крейгом Вентером, испытала секвенатор ABl 375A Sequencer вместе с рабочей станцией по катализу ABl 80 °Catalyst для приготовления проб. Лаборатория Вентера занималась секвенированием двух участков, которые, как считалось, содержали гены, ответственные за крайне важные наследственные заболевания. Несмотря на отменную работу самих устройств, гены, поиском которых занимался Вентер, найдены не были. К тому же программное обеспечение выявило значительное число ошибочных результатов, так что многое пришлось сверять вручную.

Вентеру слишком уж не терпелось пролистать длинные последовательности из генетических букв в поисках немногих нужных генов или участков генома, где закодированы белки. И его осенило, как нарастить усилия. Чтобы отыскать активные гены в определенной клетке, он сначала извлекал из клетки РНК. Раз РНК строится прежде всего на основе ДНК, она содержит последовательность парных оснований нуклеотидов, относящуюся к активным частям (генам) исходной ДНК. Затем исследователи преобразовывали РНК в более устойчивую ДНК (именуемую комплиментарной ДНК – кДНК) и для хранения присоединяли ее к хромосоме какой-нибудь бактерии, используя прием резания и склеивания с помощью рестрикционных ферментов. Комплиментарной ДНК пользуются в биологических лабораториях по всему миру, так что недостатка в ней нет. Следующий шаг связан с секвенированием кДНК и сравнением ее с другими секвенированными генами. Данный подход, названный экспрессируемыми ярлыками, [12]12
  В данном случае могут получаться не полные последовательности генов, а только отдельные их участки (как бы «ярлычки», маркирующие эти гены), которые заносят в банк данных и по которым в дальнейшем можно идентифицировать эту последовательность, если она будет выделена из других источников. Отсюда этот метод получил название «экспрессируемые ярлыки последовательностей» – Expressed Sequence Tags (ESTs).


[Закрыть]был не нов для Вентера. О нем впервые написал химик-биолог Пол Шиммел в 1983 году, а известный генетик Сидни Бреннер и другие ученые широко использовали в конце 1980 – х. Но благодаря ABI Sequencer и электронно-вычислительным рабочим станциям по возможностям секвенирования лаборатории Вентера не было равных.

В июне 1991 года Вентер написал, что при секвенировании посредством экспрессируемых ярлыков он определил около 330 активных генов в человеческом мозге. Одним словом, Вентер определил и расшифровал более 10 % известных миру человеческих генов – и все это за несколько месяцев. Со свойственной ему прямотой Вентер заявил, что «усовершенствования в технике секвенирования ДНК теперь сделали, по существу, доступным полное обследование хромосомного набора организма по экспрессируемому гену».

Следующая статья Вентера, опубликованная в журнале Nature, еще больше подогрела недовольство некоторых биологов. В этой статье он сообщал об очередных 2375 человеческих генах, выявленных в мозге, что в 2 раза превышало число генов, расшифрованных к тому времени остальным научным сообществом. Ученые опасались, что секвенирование кДНК начнут финансировать вентеровским методом экспрессируемых ярлыков как более дешевой альтернативы расшифровке всего человеческого генома. Данный подход избегал бы искусных приемов экспрессии генов вроде lac-оператора, поскольку места соединения активаторов и репрессоров не будут секвенироваться.