Текст книги "Биологически активные"
Автор книги: Станислав Галактионов
сообщить о нарушении
Текущая страница: 7 (всего у книги 20 страниц)
Из генетики
Почему-то в представлении людей, незнакомых поближе с генетической инженерией, хоть и интенсивно восторгающихся ее достижениями, этот «генетический инженер» является в образе лесковского Левши – умельца, выполняющего хитроумнейшие операции в клетке чуть ли не с помощью сверхминиатюрнейшего скальпеля, тончайших крючочков и иголочек и, конечно, «мелкоскопа».
Ничуть не бывало. Даже у самого выдающегося «генетического инженера» могут быть, как говорит мой знакомый экспериментатор, «обе руки левые». И работает он в основном головой, техническое оснащение его лаборатории – довольно несложное, а основной его инструмент – различные ферменты очень специального назначения. Именно открытие и выделение этих ферментов сделали возможной целенаправленную перестройку генетического материала.
Как известно, в клеточном ядре этот материал организован в виде хромосом, причем у высших организмов он как бы сдублирован – представлен парами хромосом, несущими информацию об одних и тех же функциональных элементах (диплоидный набор хромосом). Исключение составляют половые клетки – гаметы, в которых каждый тип хромосомы представлен лишь одиножды (гаплоидный набор); при слиянии родительских гамет вновь образуется клетка с диплоидным набором.
Знаменитые законы Менделя вытекают из такого механизма размножения. В самом деле, если родители различаются по некоторому признаку – окраска цветка, форма плода, цвет глаз и т.п., – у их потомства окажутся оба типа хромосом, определяющих соответствующий признак, – отцовская и материнская; говорят, что данный индивидуум гетерозиготен по этому признаку.
К каким последствиям это приводит? Скажем, котята, родившиеся от белой кошки и черного кота, могут быть целиком черными (или белыми – не имеет значения, пример условный) – это случай раздельной наследственности.
Если они равномерно серой масти – имеет место слитная наследственность; наконец, если они удались пятнистыми, черно-белыми, – говорят о смешанной наследственности. (По поводу последнего типа наследственности вспоминается юмористический рисунок: Ной загружает свой ковчег парами различных животных; на очереди – две крутогривые лошадки, черная и белая. Ной кричит с досадой: «Послушай, Сим, неужели ты не мог выбрать пару зебр одной масти!»)
Чем проще рассматриваемый признак, тем вероятнее, что его проявление в потомстве осуществится именно по типу раздельной наследственности. Под «простотой» здесь следует понимать величину объёма генетической информации, необходимой для его определения. Лучше всего, если речь идет об аминокислотной последовательности единственного белка. Хотя в случае раздельной наследственности у гетерозиготного индивидуума проявляется признак лишь одного из родителей – доминантный (скажем, черная масть у обсуждавшихся котят), однако каждая его клетка содержит хромосомы обоих типов.
Скрытый, как бы не проявившийся признак другого родителя называется рецессивным. У потомства же гетерозиготных родителей возможны четыре – вообще говоря, равновероятные – комбинации типов хромосом: – отцовская с доминантным геном, материнская с рецессивным; – материнская с доминантным, отцовская с рецессивным; – обе с доминантными генами; – обе с рецессивными генами.
В трех первых случаях проявится доминантный признак, в четвертом – рецессивный; вот вам и менделевское 3:1.
Далее, было отмечено, что некоторые признаки передаются только совместно: если у потомства один из них – материнский, то и второй непременно тоже. Естественно предположить, что они определяются одной и той же хромосомой.
Так появилось понятие сцепления генов; оказалось, однако, что время от времени сцепленные признаки все же разделяются. Пара гомологичных (то есть несущих набор функционально эквивалентных генов) хромосом разрывается – точно в одном и том же положении! – после чего «хвост» одной хромосомы присоединяется к «голове» другой, и наоборот. Это явление называется кроссинговером. Показано, что вероятность кроссинговера в любой точке хромосомы одинакова. Благодаря этому, наблюдая за частотами кроссинговера между генами, определяющими различные признаки, можно установить последовательность их локализации в хромосоме. Вероятность кроссинговера между парой генов пропорциональна длине разделяющего их участка хромосомы, и если наблюдаемая на опыте частота соответствующих кроссинговеров больше, чем частоты кроссинговеров каждого из этих генов с некоторым третьим, то этот третий ген, по-видимому, расположен в хромосоме между ними. Причем приблизительно выполняется правило, согласно которому сумма меньших частот равна большей.
В природе кроссинговер осуществляется в оплодотворенной яйцеклетке, в процессе сближения (конъюгации) гомологичных хромосом; следовательно, перекрестный обмен генетической информацией возможен лишь внутри вида или между близкими, скрещиваемыми видами. Основное достижение генетической инженерии заключается в том, что оказался возможным «искусственный кроссинговер» между фрагментами наследственного материала, принадлежащего каким угодно видам или даже с участием синтетических фрагментов последовательностей ДНК.
Как они это делают?
Нужно, следовательно, сначала разрезать в определенном месте двунитевую ДНК, а затем «пришить» к месту разреза другой какой-то фрагмент, также двунитевый. Для разрезания используются ферменты, называемые рестриктазами. Они разрывают двуспиральную структуру ДНК в месте включения определенной последовательности нуклеотидов. Скажем, если это ААТ (и комплементарная ей ТТА), такой разрыв может произойти в обеих нитях у противоположных концов этой последовательности.
Образующиеся в результате концы двутяжевых ДНК на жаргоне генетических инженеров называются «липкими». Взаимно комплементарные однонитевые фрагменты таких концов могут вновь сойтись, восстановив двуспиральную структуру за счет межцепных водородных связей. Тем самым они очень облегчат работу другому ферменту – лигазе, которая восстановит валентные связи в обеих цепях, разорванные рестриктазой.
...Опять к вопросу о периодическом возрождении шуток (в том числе изо) и анекдотов. Вспомните, сколько раз вам попадалась на глаза картинка: двое рабочих кончают укладывать асфальт, двое других с отбойными молотками в руках нетерпеливо поторапливают:
– Кончайте скорее, нам нужно прокладывать теплотрассу!
Шутка, конечно, незамысловатая; может быть, ни один даже средневзыскательный редактор не пустил бы ее на страницы своего издания, да беда в том, что это скорее даже и не шутка вовсе, а почти фотографическая зарисовка с натуры. Каждый из нас, увы, мог бы привести сколько угодно примеров в подтверждение, как говорится, жизненности подобной ситуации. Что поделать, не знает иной раз левая рука какого-то там управляющего, директора или предрайисполкома, что делает правая.
Не таким ли точно образом, может возникнуть вопрос, поступает и клетка? Сначала, видите ли, один фермент разрезает ДНК-овую спираль, затем другой – опять сшивает. Одно все-таки дело – головотяп-управляющий, другое – живая клетка, о мудрой согласованности процессов, которые в ней протекают, написано так много. Отвечу кратко: никакого сходства здесь нет. И те, и другие ферменты работают не бесконтрольно, а весьма согласованно; назначение их как раз и заключается в том, чтобы обеспечить обмен генетическим материалом обоих родителей в пределах одной хромосомы.
У бактерий такой способ обмена – вообще единственная возможность наделить потомка признаками обеих родительских форм сразу. Весь генетический материал бактерии организован в виде единственной кольцевой хромосомы – плазмиды; половой процесс у бактерии заключается в переносе фрагмента одной хромосомы в другую.
Если обе нити двутяжевой ДНК обрываются вместе, а не ступенькой, такие концы в отличие от «липких» называются «тупыми». Есть и ферменты, сшивающие два тупых конца, однако эта процедура реализуется труднее. Если генетическому инженеру требуется сшить два фрагмента ДНК, обладающих «липкими», но некомплементарными концами, – он использует синтетический переходник, или «линкер», – небольшой кусочек двойной спирали с соответствующими «липкими» концами.
Методы избирательного разрезания и сшивки двутяжевых нитей ДНК – лишь часть средств из арсенала генетической инженерии. Чтобы «пришить» в определенном месте фрагмент ДНК, соответствующий аминокислотной последовательности интересующего нас белка, нужно этот фрагмент иметь. В некоторых случаях (сравнительно короткие белки) это удается сделать методами химического синтеза. Можно также попытаться выделить соответствующие фрагменты ДНК из клетки, в которой происходит синтез соответствующего белка, но осуществить это практически очень трудно: содержание ДНК слишком мало. Кроме того, в геноме высших организмов участки, кодирующие аминокислотную последовательность некоторого белка, перемежаются вставками-интронами. После синтеза соответствующей молекулы информационной РНК происходит ее созревание – удаление интронов. В клетках же бактерий, которые почти исключительно используются для получения белков методами генетической инженерии, созревание РНК не происходит и, соответственно, не может быть получена нужная аминокислотная последовательность.
Поэтому наибольшее распространение получили методы ферментативного синтеза искомых фрагментов ДНК на матрице соответствующей информационной РНК, выделенной из клеток, продуцирующих нужный белок. Такой процесс, как упоминалось, называется обратной транскрипцией и осуществляется ферментом ревертазой. Чтобы ревертаза могла начать такую работу, ей нужен затравочный фрагмент ДНК – короткий участок, комплементарный началу молекулы информационной РНК.
Таким образом, получается однонитевая ДНК, «достройка» второй, комплементарной цепочки осуществляется с помощью той же ревертазы или ДНК – полимеразы. Также и здесь необходима затравка – олигонуклеотид, комплементарный начальному участку.
Но вот ген, кодирующий аминокислотную последовательность белка, получен. Если, однако, его поместить теперь в клетку, он скорее всего просто будет уничтожен ферментами, да если и уцелеет (это бывает в некоторых случаях), не будет вовлечен ни в процессы репликации, ни транскрипции. Чтобы он мог участвовать в этих процессах, необходимо встроить его в более протяженную последовательность, включающую специфический участок, ответственный за процесс репликации, – репликатор. Кроме того, отбор клеток, продуцирующих чужеродный белок, удобнее производить не путем контроля содержания самого белка, часто это затруднено технически, а по присутствию какого-нибудь сцепленного с ним фактора – фермента или антибиотика.
Соответствующий генетический материал тоже должен содержаться во вводимой в клетку чужеродной ДНК. Обычно это кольцевая ДНК, называемая на жаргоне генетических инженеров вектором. Именно для ее получения («конструирования», как говорят профессионалы, коль уж инженерия, так инженерия) используются описанные выше приемы ферментативного разрезания и сшивки ДНК. В результате в плазмиду из кишечной палочки встраивается кусочек генома человека (подумайте, что за странный гибрид!), полученная таким образом рекомбинатная плазмида вводится в клетку все той же кишечной палочки, и та вовсю начинает производить человеческийбелок, например, все тот же инсулин.
Пример, впрочем, не самый удачный, потому что, строго говоря, никакого инсулина в готовом виде эта клетка не производит. Молекула инсулина, как упоминалось, состоит из двух цепей: более короткой Аи более длинной В; в животном же организме сначала синтезируется проинсулин – единственная цепь, N-концевая последовательность которой представляет собой B-цепь, C-концевая – A-цепь, а между ними расположен соединительный фрагмент, который впоследствии выщепляется.
Для получения инсулина с использованием методов генетической инженерии были использованы два подхода. Первый предполагал синтез все же проинсулина (или сходного белка, содержащего вместо C-пептида иную аминокислотную последовательность) и последующую его конверсию в инсулин химическим путем. Второй подход базировался на получении отдельно A– и B-цепей и «сборку» из них молекулы инсулина; именно такая схема использована для получения упоминающегося коммерческого препарата. И в том и в другом случае необходимо преодолеть весьма значительные трудности, которые, впрочем, уже не имеют отношения к собственно генетической инженерии.
Инсулин, как упоминалось, был первым белковым гормоном, первым белком вообще, который стали получать в коммерческих целях методами генетической инженерии.
Следовало бы, возможно, сказать – лишь первым. В настоящее время налажено или налаживается промышленное производство этими методами таких препаратов, как интерфероны, различные белковые гормоны (например, гормон роста), некоторые ферменты.
А в не очень отдаленной перспективе специалисты видят чудеса, способные повергнуть в шоковое состояние даже самых невежественных писателей-фантастов, которые привыкли потрясать читателей своих всяческими невероятностями. Разница в том, что посулы «генетических инженеров» большей частью будут реализованы, причем гораздо быстрее, чем это кажется посторонним при первом знакомстве с ними.
Глава 4. Весьма краткое введение в теорию рецепторов
Для возникновения эндокринологии как самостоятельной отрасли биологической науки достаточно было установить сам факт существования механизма регуляции жизненных процессов описанного выше типа: вещество, выделяемое органом А, попадая с кровью в орган Б, вызывает некую реакцию. Поле деятельности новой научной дисциплины оказалось обширнейшим: с одной стороны, один за другим открывались новые гормоны, с другой – исследователи настойчиво пытались понять, каким же образом реализуется такой вот механизм «дистанционного» (как сказали бы, возможно, сейчас) управления?
Почему это самое вещество из органа Адействует именно на орган Б, спокойно минуя органы В, Г, Ди все прочие, попадающиеся ему на пути следования с кровотоком? И почему, попадая в орган Б, оно вызывает именно такую реакцию, а не какую-нибудь другую?
Рецепторы
Принципиальный ответ на оба поставленных выше вопроса был, впрочем, получен довольно скоро. В органах, управляемых данным гормоном, есть определенные центры взаимодействия, с которыми гормон может образовывать комплекс. Образование же такого комплекса инициирует развитие требуемой реакции через цепочку промежуточных звеньев – различных внутриклеточных реакций. В клетках других органов такие центры связывания и сопряженные с ними механизмы запуска ответной реакции отсутствуют, потому-то и действуют гормоны весьма избирательно на один орган (или, во всяком случае, на ограниченное их количество). Такие органы принято называть органами-мишенями, а центры взаимодействия, через которые гормон вызывает реакцию, – рецепторами этого гормона.
Как говорилось, термин «рецептор» использовал еще Эрлих, правда, в несколько более широкой трактовке. В настоящее время так называют в принципе лишь те центры связывания биологически активных соединений, которые являются элементами системы химической регуляции в организме. Впрочем, никакой точной формулировки, определяющей этот термин сегодня, нет, хотя попытки ее создания предпринимались не раз. Приведем результаты двух из них: они принадлежат виднейшим современным специалистам в области теории рецепторов и тем не менее удачными быть признаны не могут.
Д.Р. Вод: «Многие химические агенты обладают следующими четырьмя признаками: 1) они действуют в низких (микромолярных) концентрациях; 2) их активность в сильной мере зависит от изменений в химической структуре; 3) их активность может подавляться селективными антагонистами; 4) активность антагонистов также сильно зависит от изменений в химической структуре. Все эти признаки указывают на то, что в ткани имеет место специфическая реакция между данным агентом и специализированным центром связывания (рецептором)».
В этом определении использован не встречавшийся у нас ранее термин «антагонист». Здесь имеется в виду так называемый конкурентный антагонист – вещество, способное образовывать с рецептором прочный комплекс, однако не вызывающее в результате ожидаемой реакции. Занимая же рецептор, оно не допускает связывания с ним настоящего биорегулятора, тем самым блокируя или ослабляя реакцию органа-мишени на него. Отметим, что обычно антагонисты получаются незначительной модификацией молекулы природного биорегулятора: часто достаточно удаления одной-единственной функциональной группы; это, кстати, хороший пример, иллюстрирующий смысл пункта 2 в приведенной цитате.
Очевидно, что воспользоваться определением, данным Водом, на практике довольно непросто.
Условие 1 – действие в низких концентрациях – является необходимым, но недостаточным; в конце концов, тот же цианистый калий действует в микромолярных концентрациях. Далее, если мы хотим определить, являются ли центры связывания некоторого вещества рецепторами или нет, нам нужно получить каким-то образом соединение-антагонист, что зачастую весьма и весьма сложно. А главное, в принципе процесс связывания любого вещества любыми центрами взаимодействия можно подавить добавлением другого вещества, также способного связываться этими центрами. Если биологический эффект в обоих случаях будет выражен в разной степени – условие 3 можно считать выполненным.
Обратимся теперь к другому определению, принадлежащему П. Куатреказасу, им перечисляются пять основных признаков рецепторов:
«Первый: взаимодействие биорегулятора с рецептором должно отвечать требованиям определенной пространственной и структурной специфичности. Второй: количество связывающих мест должно быть ограниченным, и, следовательно, связывающие места должны быть насыщаемыми. Третий: связывание биорегулятора должно иметь тканевую специфичность, соответствующую его биологической специфичности. Четвертый: связывающие места должны обладать высоким сродством к гормону, а их концентрация должна соответствовать физиологической концентрации гормона. Пятый: связывание биорегулятора с рецептором должно быть обратимым».
Четвертый признак равнозначен первому условию Вода: агенты должны действовать в низких концентрациях. Что касается признаков второго и пятого, то они как будто очевидны; ясно, что количество мест связывания чего угодно чем угодно в организме будет ограничено, а любое связывание в принципе обратимо.
Первое требование сформулировано несколько расплывчато; по-видимому, имеется в виду взаимное пространственное соответствие центра связывания и связываемой молекулы. Можно, однако, предположить, что этот фактор играет важную роль и в более простых процессах адсорбции.
Как видно, нелегкое это дело – дать четкое определение понятия «рецептор». К чести исследователей, работающих над раскрытием механизмов действия биологически активных соединений, это нисколько не помешало изучению организации рецепторных систем многих конкретных биорегуляторов и созданию целого автономного раздела эндокринологии, молекулярной фармакологии и смежных дисциплин – теории рецепторов. Одна из книг, посвященных изложению основ этой теории, начинается так:
«Нередко на прилавках книжных магазинов или библиотечных полках встречаются издания типа «Частотный англо-русский словарь по ядерной физике», «Частотный словарь современного белорусского языка», «Частотный словарь Адама Мицкевича» и т.п.
Нам ничего не известно о существовании «Частотного словаря терминов из области биофизики, биохимии, физиологии и фармакологии». Впрочем, может быть, он и существует – в виде, например, приложения к диссертации, защищенной где-нибудь в Ванкувере или Каракасе, так что воспользоваться им в данный момент может не каждый. Однако, даже не заглядывая в такой словарь, берем на себя смелость утверждать: термин «рецептор» наверняка фигурирует в нем среди наиболее часто употребляемых».
И все это, повторяю, без наличия точного определения самого термина «рецептор». Автор рассмотренной выше попытки дать такое определение. Вод, и сам видел несовершенство своих формулировок; отчаявшись, он завершил свои рассуждения на эту тему словами: «Каждый автор имеет свое собственное определение понятия «рецептор». Я определяю его как содержащуюся в ткани структуру, которая ведет себя как Rв рассматриваемых здесь схемах. Это аналогично определению температуры как того, что ведет себя как Tв распределении Максвелла – Больцмана».
Далее следует несколько десятков страниц текста, насыщенных уравнениями (теория рецепторов – наука умеренно точная), в которых и в самом деле постоянно встречается буква R.
Существует, впрочем, и ещё один подход к определению понятия «рецептор». Его идея также принадлежит нескольким крупным авторитетам в области молекулярной фармакологии и заключается в следующем: если исследователь, обсуждая результаты своего эксперимента, утверждает, что изучаемый агент связывается в клетке, просто с «чем-то», масштабы его незнания ясны сразу; если же речь идет о взаимодействии с рецептором, создается иллюзия глубокого понимания молекулярной картины процесса. Таким образом, можно рассматривать термин «рецептор» и как средство улучшения самочувствия определенной группы профессионалов.
