Текст книги "Микрокосм. E. coli и новая наука о жизни"
Автор книги: Карл Циммер
Жанры:
Прочая научная литература
,сообщить о нарушении
Текущая страница: 9 (всего у книги 24 страниц) [доступный отрывок для чтения: 9 страниц]
Несмотря на отличия, естественный отбор может перевесить многие причудливые зигзаги истории развития вида. Может быть, линии Ленски и не идентичны, но в целом все они эволюционировали в одном направлении. Кроме того, на молекулярном уровне пути их развития тоже двигались к одной точке. Ленски и его коллеги обнаружили несколько случаев, когда один и тот же ген мутировал во всех 12 линиях. Но даже гены, у которых последовательность нуклеотидов осталась прежней, изменились примерно одинаково. Одни из них стали производить больше белка, другие меньше. Ленски с коллегами внимательно проследили, как изменилась экспрессия [17]17
Экспрессия генов – процесс передачи генетической информации, закодированной в ДНК, через РНК к белкам. – Прим. ред.
[Закрыть]генов в двух линиях E. coli.Они выявили 59 генов, и направление изменений всех 59 генов обеих линий было одинаковым. Эволюция продолжала наигрывать одну и ту же мелодию.
Густо заросший берег
«Любопытно созерцать густо заросший берег, – писал Чарльз Дарвин в “Происхождении видов”, – покрытый многочисленными, разнообразными растениями с поющими в кустах птицами, порхающими вокруг насекомыми, ползающими в сырой земле червями, и думать, что все эти прекрасно построенные формы, столь отличающиеся одна от другой и так сложно одна от другой зависящие, были созданы благодаря законам, еще и теперь действующим вокруг нас» [18]18
Дарвин Ч. Происхождение видов путем естественного отбора, или Сохранение избранных пород в борьбе за существование. Пер. К. А. Тимирязева. – М: Терра – Книжный клуб, 2009. – Прим. ред.
[Закрыть].
Дарвин не верил, что можно реально наблюдать происходящее на заросшем берегу жизни. Он утверждал, что жизнь эволюционирует и создает новые виды в течение больших промежутков времени, меняясь столь же медленно, как медленно растут горы или опускаются на дно морское острова. Он мог только оглядеться вокруг и изучить результаты эволюции, такие как распределение по миру родственных видов; по существу, это было единственным на тот момент средством восстановить историю заросшего берега. И сегодня большинство ученых, исследующих растительный и животный мир, по – прежнему идут по стопам Дарвина. Собранные ими данные свидетельствуют, что на формирование новых видов, на их отделение от видов существующих уходят обычно тысячи лет. Сидеть на берегу в надежде увидеть, как появляется новый вид, чаще всего бесполезно.
Оказывается, однако, что действие некоторых из тех сил, что управляют происхождением видов, можно наблюдать в чашке с E. coli.В начале 1990–х гг. микробиолог из Мичиганского университета Джулиан Адамс использовал для своих опытов колонию E. coli,полученную из одной бактерии. Адамс и его коллеги держали бактерии на голодном пайке из глюкозы, но, в отличие от Ленски, старались не доводить их до настоящего голода. Бактерии у них начали эволюционировать, приспосабливаясь к новым условиям. К удивлению Адамса, естественный отбор вовсе не придерживался одной – единственной стратегии. Когда ученый поместил свои бактерии в чашки Петри, в них сформировались колонии двух типов: в виде больших пятен и в виде маленьких.
Адамс решил, что исходная колонии оказалась загрязнена другим штаммом, поэтому прекратил эксперимент и начал все заново. После того как новая колония адаптировалась к диете с низким содержанием глюкозы, Адамс снова расселил бактерии по чашкам. И вновь увидел то же самое – большие и маленькие пятна колоний. Адамс повторил эксперимент еще несколько раз и обнаружил, что на формирование двух четко различимых типов бактерий требуется примерно 200 поколений. Стало окончательно ясно, что из одного клона раз за разом развивается два разных типа Е coli.
Оказывается, эти два типа – экологические партнеры. В больших колониях обитают бактерии, которые лучше своих предков умеют питаться глюкозой. При этом один из отходов жизнедеятельности этих бактерий – ацетат. Известно, что E. coliможет утилизировать ацетат, хотя растет при этом медленнее, чем при питании глюкозой. Адамс обнаружил, что часть его бактерий научилась использовать ацетат в качестве питательного вещества эффективнее, чем их предки. Бактерии, питавшиеся ацетатом, росли медленно, но никогда не вымирали, потому что использовали пищу, которую быстрорастущие бактерии утилизовать не могли. Так в лаборатории Адамса спонтанно возникла пищевая цепочка, в которой организмы зависели друг от друга.
Другие ученые подтвердили выводы Адамса собственными экспериментами и создали из единственного предка E. coliдругие примеры экологического разнообразия. Майкл Дебели и его коллеги из Университета Британской Колумбии вместо чисто глюкозной диеты изначально выращивали E. coliна среде с глюкозой и ацетатом. После 1000 поколений Дебели обнаружил, что его бактерии тоже сформировали большие и маленькие колонии. Оказалось, однако, что эти колонии отличаются от больших и маленьких колоний Адамса. Бактерии в колониях обоих типов у Дебели утилизировали и глюкозу, и ацетат, а разница между ними заключалась в выборе временного режима. Бактерии крупных колоний питались глюкозой до тех пор, пока она не заканчивалась, и лишь затем переходили на ацетат, а бактерии мелких колоний начинали делать это раньше и, соответственно, имели в питании ацетатом некоторую фору.
После этого Дебели с коллегами внимательно присмотрелись к тому, как изменились гены обитателей тех и других колоний. Как правило, если E. coliпитается глюкозой, то гены, отвечающие за расщепление ацетата, надежно подавлены. Дело в том, что, если бактерия производит одновременно оба набора ферментов (и для глюкозы, и для ацетата), они начинают мешать друг другу и устраивают своеобразную дорожную пробку. Когда наступает время переходить на другую пищу, бактерии приходится сначала уничтожить все готовые ферменты, утилизирующие глюкозу, и лишь потом приступить к синтезу ферментов для расщепления ацетата. Дебели обнаружил, что в мелких колониях естественный отбор благоприятствовал тем мутантам, которые не подавляли гены ацетатного оперона. Пока в наличии были и глюкоза, и ацетат, эти мутанты питались тем и другим, хотя делали это намного менее эффективно, чем специализирующиеся на глюкозе бактерии из крупных колоний. Жертвуя эффективностью, они получали преимущество в другом: поскольку все ферменты, участвующие в утилизации ацетата, у них были готовы заранее, они без труда опережали бактерии из крупных колоний и, пока те занимались небыстрым делом внутренней реорганизации, спокойно питались.
Возможно, эти эксперименты на E. coliпомогут пролить свет на механизм формирования новых видов. В Никарагуа, к примеру, природа придумала собственные чашки Петри в виде потухших вулканов, постепенно наполнившихся дождевой водой. Озера в кратерах этих вулканов полностью изолированы от близлежащих озер и рек, но иногда – очень редко – ураган заносит в них мальков рыб. В озере Апойо, сформировавшемся около 23 000 лет назад, живет два вида рыб семейства цихлиды. Один из этих видов – цихлазома лимонная (Cichlasoma citrinellum) – крупная рыба, которая роется в иле и поедает улиток, раздавливая их раковины. Второй – амфилофус стройный (Amphilophus zaliozus) – тонкое стремительное существо, промышляющее личинками насекомых на открытой воде. Анализ ДНК показывает, что цихлазома лимонная была заброшена в озеро уже сформировавшимся видом, а амфилофус стройный отделился от него уже в озере в результате дальнейшей эволюции. Не исключено, что процесс занял всего несколько тысяч лет.
Какие бы виды ни исследовали ученые – E. coli,цихлид или еще кого‑нибудь, им приходится сталкиваться с одним и тем же вопросом: зачем нужна специализация? Почему живые организмы не эволюционируют, наоборот, в сторону универсальности? Возможно, существуют объективные пределы того, насколько эффективно один организм может делать множество разных вещей. Рано или поздно приходится выбирать. Так, мутация, помогающая E. coliпитаться ацетатом, может одновременно снизить ее способность питаться глюкозой. Пытаясь делать все сразу, универсалы, вполне возможно, проигрывают специализированным организмам, которые умеют делать что‑то одно, зато гораздо лучше. Возможно, цихлиды в свое время столкнулись с подобным выбором. А гибридные цихлиды, скорее всего, не слишком хорошо приспособлены и к питанию улитками, и к охоте на личинок, и их ждет заведомо меньший репродуктивный успех, чем специализированных рыб на обоих концах спектра. По мере того как в экосистеме возникают новые виды, они изобретают все новые способы добычи пропитания. И со временем Дарвинов берег зарастает все гуще
Глава 6. Смерть и доброта
Князь – анархист
В 1882 Г. Чарльз Дарвин был с большой помпой похоронен в Вестминстерском аббатстве. Но уже очень скоро его наследие стало вызывать среди биологов горячие споры. В 1886 г. британский зоолог Томас Гекели опубликовал шокирующий очерк под названием «Борьба за существование и ее влияние на человека». В нем автор нарисовал весьма непривлекательную картину природы как мира, где каждый сражается против каждого. «Животный мир представляет собой что‑то вроде гладиаторского шоу, – писал Гекели. – Зверей в нем сравнительно неплохо содержат и выпускают драться. Самый сильный, быстрый и хитрый остается в живых, чтобы завтра вновь вступить в схватку. Зрителям нет нужды показывать обращенные вниз большие пальцы – снисхождения в этом мире не бывает». Гекели считал, что человеку, чтобы придерживаться принципов морали, необходимо идти против собственной природы.
На очерк Гекели последовал язвительный ответ от одного князя – анархиста. Петр Кропоткин родился в 1842 г. в семье богатого русского аристократа. При Александре II он окончил элитное военное учебное заведение – Пажеский корпус, но успел разочароваться в придворной жизни и попросился служить в Сибирь. Там он работал секретарем комиссии по тюремной реформе, и ужасы, свидетелем которых он стал в каторжных лагерях, превратили князя в радикального анархиста. В то же время он вырос до первоклассного ученого. В 1864 г. Кропоткин впервые принял участие в географической экспедиции и следующие восемь лет занимался исследованием сибирских ландшафтов.
После возвращения из Сибири Кропоткин очень быстро оказался в тюрьме за свои политические убеждения. Он бежал и перебрался в Европу, где начал писать политические памфлеты; это творчество принесло ему славу – и новые тюремные сроки. Очерк Гекели появился в печати в тот момент, когда Кропоткин, отсидев три года, вышел из французской тюрьмы. Он обосновался в Англии и немедленно приступил к написанию целой серии критических очерков, направленных против Гекели и его, как он считал, неправильных взглядов и на человека, и на природу. Позже его очерки были изданы в виде сборника «Взаимопомощь как фактор эволюции», который стал бестселлером.
Кропоткин утверждал, что мораль не искусственна и не связана с цивилизацией, а наоборот, изначально естественна для человека и определяется самой глубинной его природой. «Взаимная помощь – такой же закон природы, как и взаимная борьба», – писал он. Сотрудничество появилось и развилось благодаря тем преимуществам, которые оно обеспечивает по сравнению с эгоистичным поведением. Животные не бросают друг друга, а проявляют заботу и взаимопомощь. Кропоткин рассказывает один случай за другим, приводит бесконечные примеры деятельной доброты в животном царстве – от лошадей, которые помогали друг другу уйти от степного пожара, до мечехвостов, помогавших лежащим на спине товарищам перевернуться обратно.
Можно только гадать, что подумал бы Кропоткин о E. coli.Вероятно, ему было бы приятно наблюдать, как миллиарды микроорганизмов работают вместе на строительстве биопленки, и следить за путешествиями целых стай бактерий, где все особи переплелись жгутиками. Возможно, его поразило бы бескорыстное самопожертвование бактерий, превращающих себя в живую колициновую бомбу ради того, чтобы избавиться от представителей других штаммов. А возможно, Петр Алексеевич совсем не удивился бы этому. В конце XX в. дух сотрудничества, владеющий E. coli,стал для ученых неожиданным открытием, но Кропоткин еще сто лет назад написал пророческие слова: «Взаимная помощь встречается даже среди самых низших животных, и мы, вероятно, узнаем когда‑нибудь от лиц, изучающих микроскопическую жизнь стоячих вод, о фактах бессознательной взаимной поддержки даже среди мельчайших микроорганизмов» [19]19
Кропоткин П. А. Взаимная помощь среди животных и людей как двигатель прогресса. – М: Либроком, 2011. – Прим. ред.
[Закрыть].
Кропоткин принадлежал к той же научной эпохе, что и Дарвин. Он был типичным для XIX в. наблюдательным натуралистом и ничего не понимал ни в ДНК, ни в мутациях. О том, как в клетках возникают мутации и как они помогают особи победить во внутривидовой конкурентной борьбе, ученые узнали только в середине XX в. Но и этот взгляд на эволюцию при своем появлении оттолкнул многих биологов точно так же, как картина гладиаторских боев внутри вида, которую рисовал Гекели, отталкивала Кропоткина.
Интеллектуальные внуки Кропоткина спрашивали, как конкуренция между особями может дать начало новой стратегии поведения, полезной не для особи, а для группы. Так, рыбы объединяются в гигантские косяки, которые движутся согласованно, почти как единый организм. Стерильные рабочие муравьи заботятся о потомстве своей матки. Сурикат готов стоять на страже, чтобы его сородичи могли спокойно заниматься поисками пищи. Но ведь мутация, заставляющая суриката стоять столбиком и охранять покой своих товарищей, делает его самого куда более уязвимым! Даже предполагая, что естественный отбор способен породить подобные самоотверженные стратегии поведения, биологи недоумевали, как он может сделать так, чтобы отдельные особи не пользовались беззастенчиво альтруизмом других.
Для E. coliэто совсем не умозрительный вопрос. Когда у колонии микроорганизмов заканчивается пища, ее члены, вступая в стационарную фазу, начинают сложный совместный танец. Микроорганизмы обмениваются сигналами, цель которых – синхронизировать действия по свертыванию ДНК и прекращению производства белков. Вступая в стационарную фазу одновременно, бактерии тем самым повышают свои шансы на то, что по крайней мере некоторые из них уцелеют до того момента, когда внешние условия вновь улучшатся, хотя многие, скорее всего, погибнут. Но Роберто Колтер из Гарварда и его бывший студент Марин Вулич обнаружили, что некоторые бактерии не принимают участия в этом танце смерти.
Вулич и Колтер обнаружили, что в такой колонии время от времени возникают мутанты, способные очнуться от своего «летаргического сна» – стационарной фазы – и вновь начать питаться. При этом в качестве источника питания они используют не сахара, а аминокислоты, которые выделяют их спящие товарищи. Затем бактерии, находящиеся в стационарной фазе, начинают понемногу умирать; при этом их оболочки разрушаются и содержимое выходит наружу. Мутанты утилизируют белки и ДНК погибших родичей. Рацион получается достаточно жалкий, но на размножение все же хватает. Через несколько недель потомки «нарушителей конвенции» уже играют в популяции ведущую роль.
Такое предательство наблюдалось в ходе эксперимента нередко. Стоило посадить популяцию E. coliна голодную диету, и в ней время от времени появлялись и процветали обманщики. Это происходит в соответствии с фундаментальными законами современной эволюционной биологии: благодаря случайным мутациям и конкуренции между особями в популяции в борьбе за репродуктивный успех. Остается лишь гадать, почему, если обманщики с такой легкостью добиваются успеха, сотрудничество вообще существует.
Сила в численности
В 1950–е гг. некоторые ученые объясняли сотрудничество среди животных при помощи гипотезы группового отбора. Они утверждали, что большие группы неродственных животных конкурируют между собой точно так же, как конкурируют между собой отдельные особи. Приспособления, позволяющие одним группам размножаться быстрее, чем другим, должны со временем получать более широкое распространение в популяции. Согласно этой гипотезе, групповой отбор может создавать черты и поведенческие стратегии, которые идут на пользу многим, а не нескольким особям. К примеру, в некоторых птичьих колониях каждый год может завести потомство лишь треть взрослых птиц. Сторонники теории группового отбора утверждали, что птицы намеренно сдерживаются, чтобы колония не разрослась слишком сильно и не уничтожила все пищевые ресурсы. Они даже смерть рассматривали как результат группового отбора, который устраняет стариков и позволяет молодежи достаточно хорошо питаться, чтобы завести и вырастить потомство.
Некоторое время теория группового отбора была очень популярна. Начались даже разговоры о поведении, направленном «на благо вида». Однако к 1960–м гг. критики не оставили от этой теории камня на камне. Они указывали, что изменения, в том числе и полезные, при групповом отборе происходят очень медленно – гораздо медленнее, чем при действии естественного отбора на уровне отдельных особей (как, к примеру, при появлении обманщиков). Джордж Уильямс, эволюционный биолог из Университета штата Нью – Йорк в Стоуни – Брук, собрал и обобщил множество подобных аргументов. В своей вышедшей в 1966 г. книге «Адаптация и естественный отбор» (Adaptation and Natural Selection) Уильямс заявил, что аргументы сторонников группового отбора – всего лишь результат лености мысли. Если ученые не в состоянии понять, как может естественный отбор привести к появлению того или иного приспособления, то, скорее всего, они просто не дали себе труда как следует подумать над этим вопросом.
Уильямс заявил, что большинство фактов в биологии, какими бы загадочными они ни казались на первый взгляд, представляют собой результат действия жесткого естественного отбора на отдельные особи популяции. Возьмите, к примеру, косяк рыбы, который ведет себя в воде как единый сверхорганизм. Может показаться, что каждая особь здесь сотрудничает с остальными ради блага группы и делает все, чтобы косяк в целом смог уйти от хищников – даже если это означает, что особь, о которой идет речь, будет съедена. Уильямс же утверждал, что стайное поведение может возникнуть в результате стремления каждой отдельной рыбы увеличить свои шансы на выживание – забраться в центр косяка или пытаться угадать появление хищника по поведению остальных рыб.
Тем временем в Англии еще один молодой биолог по имени Уильям Гамильтон обратил внимание на то, что в спорах о естественном и групповом отборе ученые забывают еще об одной важной вещи: о семье. Естественный отбор подхватывает те мутации, которые помогают повысить частоту встречаемости генов в популяции. Один из способов сделать это – завести как можно больше здоровых детей. Но Гамильтон сумел показать, что особь может способствовать распространению своих генов и тем, что будет помогать размножаться своим родичам.
Гамильтон говорил в основном об общественных насекомых, таких как муравьи и пчелы. Хотя стерильная рабочая самка муравья сама завести потомство не может, это вовсе не означает, что ее гены не могут быть переданы следующему поколению. Все рабочие самки в муравейнике – дочери матки и, соответственно, сестры тем муравьям, которые вырастут из сегодняшних яиц. Это означает, что каждая рабочая самка помогает растить муравьев, которые имеют с ней частично общие гены. Более того, благодаря особенностям генетики насекомых у рабочей самки – муравья больше общих генов с потомками матки, чем было бы с собственным потомством. Гамильтон предложил математическую модель генов, переходящих от поколения к поколению. Получилось, что в том случае, если альтруизм помогает передать гены следующему поколению с большей вероятностью, чем непосредственное размножение, он вполне может быть подхвачен естественным отбором. Групповой отбор возможен, утверждал Гамильтон, но лишь в том случае, если в качестве группы рассматривать расширенную семью.
Уильямс и Гамильтон оказали на биологию сильнейшее влияние. Можно было подумать, что они изобрели и пустили в обращение универсальный ключ, при помощи которого ученые смогли расшифровать многие загадочные природные закономерности. К примеру, почему некоторые животные ухаживают за своими потомками, тогда как другие бросают их сразу после рождения? Появилась возможность с математической точностью предсказывать самые интимные подробности поведения видов. Как зоологи Уильямс и Гамильтон были далеки от проблем эволюции микроорганизмов, таких как Е. coli.Оказалось, однако, что во многих отношениях эта бактерия тоже свидетельствует в пользу их взглядов.
В частности, в том, что обманщики до сих пор не захватили абсолютное лидерство в популяциях E. coli,нет ничего особенно загадочного. Конечно, эти особи могут поддерживать собственную жизнь за счет своих товарищей, находящихся в стационарной фазе, но, как говорится, за все надо платить. Превращение обычной бактерии E. coliв обманщицу и иждивенку происходит при мутации гена, получившего название rpoS.В обычных условиях этот ген работает как ген – регулятор: в ответ на стресс он включает сотни других генов. В случае голода и действия других неблагоприятных факторов rpoSвключает гены, которые помогают ввести E. coliв стационарную фазу. Если какая‑нибудь мутация заблокирует rpoS,то метаболизм бактерии не будет остановлен; вместо этого E. coliначнет питаться и расти.
Подобно многим другим генам, rpoSиграет в жизни E. coliне одну, а множество ролей. Когда бактерия попадает в человеческий желудок и чувствует, что оказалась в кислотной ванне, rpoSв ответ на этот стресс включает гены, помогающие противостоять кислоте. Обманщики не в состоянии выставить такую защиту, так что к моменту выхода из желудка они, скорее всего, будут уже мертвы. Получается, что обманщики, выигрывая на одном этапе, проигрывают, если рассмотреть жизненный цикл E. coli,в целом.
Даже биопленка E. coli– чудесное предприятие, построенное на сотрудничестве и самопожертвовании, – может оказаться вовсе не таким образцом альтруизма, каким кажется на первый взгляд. Два гарвардских биолога, Жуан Шавьер и Кевин Фостер, обнаружили свидетельства того, что стимулом к возникновению биопленки может послужить конфликт. Шавьер и Фостер построили сложную математическую модель биопленки и попытались сравнить, какие бактерии окажутся успешнее: те, которые способны образовывать биопленку, выделяя полимеры (полисахариды, липополисахариды, гликопротеины) и формируя внеклеточный матрикс, или те, которые этого делать не могут. Шавьер и Фостер засеяли пустую питательную среду теми и другими бактериями и дали колониям разрастись.
Ученые выяснили, что поначалу бактерии, формирующие биопленку, проигрывают тем, которые на это не способны, потому что им приходится тратить энергию не только на рост. Но вскоре соотношение меняется. Размножаясь, бактерии поглощают весь окружающий кислород и уже не могут так быстро расти. А образующие биопленку бактерии не испытывают недостатка в кислороде, поскольку строят постоянно увеличивающийся холмик, на котором может расти их потомство. Концентрация кислорода вокруг них выше, поэтому растут они быстрее, а это позволяет им формировать еще более высокие холмы из биопленок. Под растущим холмом старые бактерии погибают, но их потомки – а значит, и их гены, – продолжают жить. Тем временем бактерии, не образующие внеклеточного матрикса, оказываются в ловушке растущей биопленки и ничего не могут сделать; конкуренты их попросту погребают в слизи. В некоторых отношениях биопленка напоминает не столько город, сколько лес, в котором деревья изо всех сил тянутся кверху, чтобы получить свою долю солнечного света и избежать густой тени соперников.
Конфликт и сотрудничество находятся в шатком равновесии всюду, где тесно соприкасается множество клеток, будь то бактериальные клетки E. coliили клетки нашего собственного организма. Мы с вами происходим от одноклеточных предков, которые, вероятно, сильно напоминали амеб. В какой‑то момент они начали образовывать колонии, которые постепенно превратились в коллективы, составленные из множества особей, – в то, что мы называем животными. Они, как и прежде, общались между собой, но теперь поступающие сигналы заставляли их специализироваться, делиться на различные типы, формировать ткани и органы. Всякий раз при формировании нового животного большинству клеток его тела приходилось приносить последнюю, абсолютную эволюционную жертву. Они должны были стать частью тела животного и умереть вместе с ним. Только у сперматозоидов и яйцеклеток оставался малейший шанс передать свои гены потомству.
Надо сказать, что существовать в составе многоклеточного организма очень непросто. Чтобы правильно сформировать взрослый организм, большинство клеток должны сначала многократно делиться, а затем прекратить деление. Некоторые типы клеток не теряют способность к регенерации, но размножаться они должны только в той мере, в какой это необходимо для заживления раны или обновления слизистой оболочки кишечника. К несчастью, любая делящаяся клетка может мутировать, точно так же как делящаяся E. coli,и в некоторых случаях мутация превращает ее в бунтовщика. Такая клетка начинает неумеренно размножаться, игнорируя сигналы, которые приказывают ей остановиться. Она производит массу клеток – мятежников, и в этой массе возникают новые мутации – а значит, и еще более непокорные клетки. Эти клетки изобретают новые способы обойти защитные системы организма, обманом заставляют его подвести к себе новые кровеносные сосуды и безотказно снабжать кислородом и питательными веществами. Эти клетки становятся обманщиками – в точности как клетки – обманщики, умудряющиеся обернуть сотрудничество E. coliна пользу лично себе. Преуспевание таких клеток мы называем раком.
