Текст книги "От пекарни до биофабрики. Обзор достижений биотехнологии"

Автор книги: Илька Реннеберг

Соавторы: Рейнхард  Реннеберг
сообщить о нарушении

Текущая страница: 5 (всего у книги 9 страниц)

Конструирование микроорганизмов

Знакомство с кишечной палочкой

Из всех живых существ, пожалуй, лучше всего изучена кишечная палочка (колибактерия, Escherichia coli). Эти бактерии, открытые венским врачом Теодором Эшерихом (1857—1911), в огромных количествах населяют органы пищеварения животных и человека и даже снабжают своих «хозяев» витаминами, которые они могут образовывать из cахаров.

Эти невидимые «жильцы» кишечника стали знамениты благодаря своему штамму К 12, изолированному в 1922 г. Чтобы отличить микробные штаммы один от другого, их нумеруют. Штамм К 12 очень удобен для экспериментов, так как полностью утратил жизнеспособность в кишечнике человека и животных. Такие микробы характеризуются как «искалеченные лабораторные бактерии», так как теперь они хорошо себя чувствуют только в определённом питательном растворе, но не в своей исходной естественной среде. Тем самым сводится к минимуму опасность случайного заражения и последующего заболевания исследователей во время эксперимента.

Клетка Escherichia coli имеет около 1 мкм (1 мкм = 0,001 мм) в ширину и примерно вдвое большую длину. Следовательно, эти короткие палочки нельзя рассмотреть в подробностях невооружённым глазом, это можно сделать только с помощью электронного микроскопа. Что же мы увидим?

Стенки колибактерии имеют общую толщину около 0,02 мкм. Они образованы оболочкой, состоящей из деревянистых и жироподобных веществ. В стенках расположены маленькие запирающиеся поры, окружённые кольцом из белковых тел, и большое количество канальцев. Через эти отверстия пищевые вещества проходят во внутренний объём клетки. Снаружи клетка покрыта слизистой массой, из которой выступают длинные жгутики[15]15
  Жгутики – нитевидные подвижные выросты клетки. – Прим. перев.


[Закрыть], которые непрерывно вращаются и продвигают бактерию.

Клетка заполнена водой, в которой «плавают» (растворены) миллиарды молекул, образуя густой вязкий «суп» – цитоплазму (клеточную плазму). В цитоплазме находится 200 миллионов молекул сахара. В накопительных отсеках клетки длинные цепи соединённых между собой сахаров отлагаются в форме крахмала. К этому следует добавить 30 миллионов молекул аминокислот и 25 миллионов тонкодиспергированных молекул жиров. Из трёх главных строительных «блоков» – сахара, аминокислоты и жира – построены почти все вещества клетки. Всего в одной клетке содержится примерно 1 миллион молекул белка. Белки состоят из длинных цепей аминокислот. В одной клетке присутствует приблизительно 5000 различных типов белковых молекул: некоторые белки используются клеткой как строительный материал, у иных белковых молекул другие функции. Так фибриллярные (нитевидные) белки способны сокращаться; это «мышечные белки», которые приводят в движение жгутики кишечных палочек. Транспортные белки осуществляют перенос вещества внутрь клетки или из клетки в окружающую среду (продукты жизнедеятельности клетки).

Однако многие молекулы белков имеют на своей поверхности углубления, или расщелины. Это и есть белки-ферменты. Они обусловливают все превращения веществ в клетке: расщепление пищи, приобретение энергии и построение новых веществ.

Подобно рабочим на фабрике, ферменты организованы в специальные подразделения. Ферменты либо свободно плавают в цитоплазме, либо прочно закреплены во впячиваниях клеточной стенки или на других частях клетки. При этом ферменты, как на конвейере, передают друг другу продукты своих реакций.

В кажущемся хаосе клетки существует порядок, потому что каждый фермент специализирован. Каждый фермент настроен на продукт реакции своего предшественника, он может воздействовать только на этот продукт и благодаря этому цепочка превращений в клетке продолжается дальше.

Следует только представить себе, что в клетке в одну секунду одновременно протекают превращения с участием нескольких тысяч различных веществ – и это в объёме, равном всего 1 · 10⁻⁹ мм³!

Клетка кишечной палочки (колибактерия, Escherichia coli) и некоторые количественные данные о ней. 1 нм = 0,001 мкм = 1 · 10 ⁻⁶  мм.

Строение клетки Escherichia coli.

ДНК – наследственная нить жизни

Продолжим рассмотрение увеличенной под микроскопом бактериальной клетки. Внутри клетки просматривается гигантский клубок, образованный спутанной нитью. Эта нить состоит из двух скрученных одиночных цепей, имеет толщину всего лишь 0,002 мкм и кольцеобразно замкнута. Если бы мы смогли распутать эту нить, то нам пришлось с удивлением констатировать, что её общая длина составляет 1,4 мм, то есть примерно в 1000 раз превышает длину клетки бактерии. Она умещается в клетке только потому, что так плотно скручена. Наряду с этим в клетке присутствуют «карликовые нити», образующие маленькие кольца,– плазмиды. Все эти нити – носители наследственной (генетической) информации и состоят из особого вещества, которое имеет трудно произносимое название – дезоксирибонуклеиновая кислота, сокращённо ДНК.

В 1953 г. два исследователя, молодой американский биолог Джеймс. О. Уотсон (1928) и английский физик Френсис Н. К. Крик (1916), предложили гипотезу относительно того, каким образом в ДНК аккумулируется вещество наследственности всех живых существ и как оно передаётся потомству. Работы Уотсона и Крика были столь же значительны для нашего понимания жизни, как, к примеру, модель атома Нильса Бора для развития физики или периодическая система элементов Дмитрия Менделеева и Лотара Мейера[16]16
  Юлиус Лотар Мейер (1830—1895) – немецкий химик. В 1870 г. (вслед за Д. И. Менделеевым) составил полную таблицу химических элементов. По словам самого Мейера, эта таблица в существенном идентична данной Менделеевым.– Прим. перев.


[Закрыть] для химии. В 1962 г. Уотсону и Крику за цикл работ по ДНК была присуждена Нобелевская премия.

У всех представителей живой природы – бактерий, мышей, деревьев, цветов, человека и слона – ДНК построена по одному и тому же принципу. Молекула ДНК хранит все «инструкции», необходимые для того, чтобы направлять и регулировать жизнедеятельность клетки. Инструкции закодированы в последовательности строительных блоков ДНК. ДНК можно сравнить также с перфолентой. На «перфолентах» ДНК имеются указания относительно того, какую молекулу белка должна производить клетка в тот или иной момент на своих «машинах» по производству белка.

Молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) – наследственного вещества – состоит из двух обвивающих друг друга одиночных цепей (нитей) (выделены голубым цветом), в которых с помощью определённой последовательности четырёх различных строительных «блоков» (обозначены красным и жёлтым цветом) закодирован «приказ» (инструкции) по построению белков из аминокислотных остатков. Определение пространственной структуры ДНК явилось результатом многолетних исследований с использованием современных рентгеноструктурных методов анализа, методов химического анализа, а также ЭВМ. Представленное здесь изображение было получено на ЭВМ, в которую была введена вся имеющаяся информация о расположении отдельных атомов.

Роль клеточных «машин» по производству белка выполняют рибосомы, внешне представляющие собой сдвоенные сферы; в каждой бактериальной клетке сосредоточено примерно 10 000 рибосом.

Как функционирует рибосома? Рибосомы связывают свободно перемещающиеся в клетке молекулы аминокислот в длинные цепи, которые затем скручиваются и образуют таким образом шарообразные или нитевидные молекулы белков. В одну секунду одна-единственная рибосома связывает друг с другом от 10 до 20 строительных «блоков» – молекул аминокислот. Так как молекула белка обычно состоит из нескольких сотен аминокислот, то, значит, она может быть построена за какие-нибудь 10 с. Закодированный приказ о том, что следует строить данный белок, рибосома получает от ДНК. Кстати, в клетках растений и животных цепи ДНК не «плавают» свободно, как в бактериальной клетке, а заключены в оболочку, образуя клеточное ядро.

Как же выглядит «приказ ДНК»? В переводе на человеческую речь он означал бы следующее: «Внимание, рибосома! Старт! Начинай, согласно данному приказу, синтезировать белок „X“! Используй в качестве «стройматериала» молекулы следующие строительные блоки…» (далее следовали бы закодированные обозначения аминокислот, из которых состоит белок «X»).

При этом число и последовательность аминокислот в цепи для каждого определённого «типа белка» всегда одинаковы. Различные типы белков различаются по числу и последовательности аминокислот. Следовательно, амилаза имеет иную аминокислотную последовательность, чем, например, сычужный фермент.

Но каким образом приказ от плотно скрученных двойных цепей ДНК доходит к тысячам рибосом, распределённым в цитоплазме? Для этого клетка производит множество «отпечатков» приказа ДНК, как бы копий. Например, когда клетка должна срочно построить амилазу, чтобы превратить крахмал в сахар, в клубке ДНК «отыскивается» участок с записанным в нём приказом синтезировать белок амилазу. Длина ДНК, содержащей этот приказ, составляет около 0,0001 мм. Вот этот участок ДНК с предписанием о синтезе белка, а также другие подобные участки и называются «геном». Можно представить себе, как трудно отыскать нужный ген на сильно скрученной цепи ДНК общей длиной всего лишь 1,4 мм. Тем не менее клетка выполняет это за доли секунды! Итак, ген амилазы «найден». Теперь с этого гена снимаются копии. Для этого существуют специальные ферменты, которые постоянно «прокатываются» вдоль цепи ДНК и копируют её приказы, составляя из аналогичных строительных «блоков» новую цепь, идентичную «материнской цепи». Затем эта ДНК-копия отъединяется от «материнской» ДНК. Новая цепь имеет длину, равную длине гена, и содержит точно такой же приказ, что и ген на «материнской ДНК». В отличие от «материнской» ДНК, состоящей из двух скрученных цепей, ДНК-копия представляет собой всего лишь одиночную цепь. Для полученной копии принято название информационная рибонуклеиновая кислота (мРНК; буква «м» от англ. messenger – вестник).

К готовой ДНК-копии молниеносно присоединяется несколько рибосом, они «нанизываются» на неё по всей длине и «считывают» приказ о сборке молекул аминокислот для построения амилазы. Рибосомы «слепо» повинуются и составляют предписанные цепи из аминокислот. При этом из рибосом – этих «машин» по производству белка – как бы выскальзывают связанные друг с другом аминокислоты. Работа идёт, аминокислотные цепи становятся всё длиннее, по мере того как рибосомы всё дальше «нанизываются» на ДНК-копию. Но вот рибосомы расшифровали ДНК-копии. Теперь: «Стоп! Белок готов!» Далее рибосомы отторгают выходящие из них длинные аминокислотные цепи. Последние тотчас же сворачиваются в клубки и образуют белки в форме шариков с выемкой на поверхности. Итак, белок амилаза построен и в качестве фермента может немедленно приступить к расщеплению крахмала на строительные «блоки» – молекулы сахаров. Тем временем вдоль ДНК-копии наслаиваются новые рибосомы, и таким образом образуется всё больше молекул амилазы. Если надобность в амилазе исчезает, специальные ферменты вновь разлагают ДНК-копии на составляющие их строительные блоки. После этого рибосомы уже не продуцируют белков.

«Работа» бактериальной клетки по инструкции, получаемой от ДНК. Клетка синтезирует молекулы белка из аминокислотных остатков.

На самом деле все эти процессы значительно сложнее. Последние 30 лет наука интенсивно занимается тем, чтобы всё-таки выяснить некоторые из важнейших законов, лежащих в основе построения хотя бы наиболее простых клеток. Но на что же можно употребить полученные нами знания?

Человеческий белок из бактерий?

В июле 1980 г. газеты всего мира обошло известие о том, что в одной из лондонских больниц 17 добровольцам были сделаны инъекции инсулина.

Что же в этом сообщении было такого примечательного? Ведь инсулин известен уже в течение многих лет.

Инсулин – это белок, вырабатываемый так называемыми островными клетками поджелудочной железы в организме человека и животных. Он регулирует содержание сахара в крови. Кровь транспортирует сахар, поступающий вместе с пищей, во все клетки организма. Если же организм не вырабатывает достаточного количества инсулина, то возникает сахарная болезнь (диабет): неусвоенный сахар переходит в мочу и организм теряет ценные питательные вещества. В настоящее время больному действенным образом могут помочь только инъекции инсулина.

Инсулин обычно получают из поджелудочных желёз убойных свиней и крупного рогатого скота. Однако не каждый больной сахарной болезнью в состоянии переносить инсулин, полученный от животных. Молекула инсулина состоит из многих аминокислот. В инсулине свиньи лишь в одном участке аминокислотной цепи содержится аминокислота, иная, чем в инсулине человека, а инсулин крупного рогатого скота отличается от человеческого по трём аминокислотам. Эти незначительные отклонения приводят к тому, что у некоторых больных диабетом вырабатываются антитела против инсулина животных. Таким больным может помочь только инсулин человека. Но откуда взять такой инсулин в больших количествах?

Решение проблемы было осуществлено методами современной биотехнологии: бактерии кишечной палочки были подвергнуты преобразованиям, после чего они стали вырабатывать в больших количествах человеческий инсулин! Вот и объяснение тому, почему поступившее из Лондона сообщение об инсулиновых инъекциях было сенсационным: ведь впервые в истории человечества для лечения людей применили человеческий белок, выработанный микробами!

Но как можно заставить бактерии образовывать белок, который контролирует уровень сахара в крови человека, то есть белок, полностью «бесполезный» для бактерий?

Главная идея была проста и гениальна: в ДНК бактерий следует каким-либо образом ввести фрагмент ДНК с приказом о синтезе человеческого инсулина, то есть ген инсулина; иными словами, бактерии надо «подложить кукушкино яйцо». Быть может, рибосомы бактерий «обманутся» и начнут продуцировать человеческий белок как свой собственный?

Вроде бы просто, но, чтобы осуществить идею, пришлось провести огромную предварительную работу. Было известно, каким образом составлена молекула инсулина из аминокислотных строительных «блоков», следовательно, было известно и то, как должна выглядеть инструкция, записанная в ДНК, то есть каков должен быть ген инсулина. В конце концов удалось сконструировать в пробирке ген инсулина человека. Уже одно это было грандиозным научным достижением! Теперь «яйцо кукушки» было готово, но всё ещё отсутствовала сама «кукушка» – средство для транспортировки гена в бактериальную клетку.

И тут вспомнили о плазмидах, маленьких кольцевых ДНК в бактериальных клетках. Именно с плазмидами связаны те затруднения, которые испытывает медицина при лечении больных. Плазмиды содержат, например, гены пенициллиназ – ферментов, расщепляющих пенициллин,– и при воздействии пенициллина на клетки – хозяева плазмид – последние немедленно передают своим рибосомам приказ о выработке пенициллиназ. В результате скорым порядком синтезируются пенициллиназы, которые тотчас же инактивируют пенициллин – и бактериальная клетка остаётся жизнеспособной.

Мало того! При соприкосновении двух бактерий плазмида может перейти из одной бактерии в другую и передать ей охранительный приказ к защите против пенициллина.

Стенли Коэн (1928) первый предложил использовать «страсть плазмид к путешествиям»: «Они, вероятно, могли бы быть идеальным транспортным средством для генов!» Что для этого нужно? Извлечь плазмидное кольцо из бактериальной клетки, разрезать его, вставить кусок чужой ДНК с приказом о выработке белка и ввести обратно в бактерию новое плазмидное кольцо с чужим геном. Последовательность операций известна. Но…

Каким способом разрезать нить ДНК плазмиды толщиной в одну миллионную миллиметра? Разумеется, это невозможно сделать с помощью ножниц или ножей. Однако в шестидесятых годах швейцарский биохимик Вернер Арбер (1929) открыл ферменты, которые «разрезают» ДНК на маленькие кусочки. Эти ферменты получили название рестриктаз.

Квакающие бактерии?

Спустя десятилетие после открытия рестриктаз Герберт Бойер (1935), работавший в Сан-Франциско, установил, что эти «ферментативные ножницы» разрезают ДНК только в определённых местах. Другие исследователи открыли ферменты, названные лигазами, которые снова «склеивают» разрезанные участки. Тем самым исследователи стали обладателями и «ножниц» и «клея» для ДНК. В июле 1973 г. Коэн и Бойер приступили к осуществлению своих идей в лаборатории. Они выделяли из бактериальной клетки плазмидные кольца и разрезали их «ферментативными ножницами». Затем они выделяли ДНК из клеток лягушек, вырезали из них с помощью тех же «ферментативных ножниц» определённые участки и смешивали в пробирке эти фрагменты лягушачьей ДНК с разрезанными кольцами бактериальных плазмид. После этого они добавили «склеивающий» фермент. Лягушачья ДНК была встроена между открытыми концами бактериальной плазмиды, кольцо замкнулось. Затем эту плазмиду с встроенной лягушачьей ДНК учёные снова ввели в клетку бактерии. Результат оказался сенсационным: бактерии действительно дали себя «обмануть»! Правда, они не стали квакать на лягушиный лад, как шутили Коэн и Бойер. Однако теперь их рибосомы наряду с их собственными бактериальными белками образовывали и белок лягушки! И все их потомки несли в себе часть наследственной информации лягушек!

Таким образом, Коэн и Бойер нашли метод, посредством которого в наследственный материал микроорганизма можно добавить чужие гены. Эти новые методы стали известны как методы генной инженерии. В 1978 г. был достигнут следующий этап: «сконструированный» в пробирке из строительных «блоков» ДНК ген инсулина человека был встроен (подобно лягушачьей ДНК) в разрезанные кольца плазмид бактерий, после чего плазмиды были внесены обратно в бактерии. И теперь бактерии стали продуцировать инсулин человека.

Апробация человеческого инсулина из бактерий дала прекрасные результаты. В некоторых клиниках его уже применяют для лечения больных диабетом.

Интерферон – первое лечебное средство против вирусов

Ген инсулина мог быть искусственно сконструирован химиками в пробирке, потому что было известно, как он построен. А как быть, если строение гена неизвестно?

Один неизвестный белок особенно привлекал внимание биотехнологов. Уже в пятидесятых годах было обнаружено, что в клетках живых существ, поражённых вирусами, образуется интерферон – белок, который «предостерегает» и защищает от вирусов ещё непоражённые клетки.

Интерферон мог бы стать первым лечебным средством против вирусных заболеваний. Ведь, как известно, существующие антибиотики не оказывают никакого воздействия на вирусы, они только «подавляют» развитие тех бактерий, которые могли бы распространиться при вирусном заболевании в организме, ослабленном вирусами. Поэтому создание лечебного средства против вирусов означало бы для медицины прогресс не меньший, чем введение в лечебную практику пенициллина. Стоит только вспомнить хотя бы о том, как много людей ежегодно болеет вирусным гриппом!

Однако до появления методов генной инженерии интерферон мог быть получен лишь в ничтожных количествах из лейкоцитов (белых кровяных клеток). Для получения 1 г интерферона нужно переработать кровь от 90 000 доноров.

Мысль о том, чтобы заставить микробов вырабатывать человеческий интерферон в больших количествах, занимала многие умы. В 1978 г. работу в этой области начал профессор Чарльз Вейссман, биохимик из Цюрихского университета. Прежде всего он «заразил» лейкоциты человека вирусами. Вследствие этого клетки были вынуждены образовывать интерферон для защиты остальных клеток. Следовательно, клеточная ДНК посылала своим рибосомам наряду с приказами о синтезе «нормальных» белков также ДНК-копии с командой: «Вырабатывайте белок интерферон!»

Однако этот приказ о синтезе интерферона Вейссману пришлось разыскивать среди тысяч других распоряжений ДНК кровяных клеток. Для этого он отделил бесчисленное количество различных «одноцепочечных» ДНК-копий от прочих компонентов кровяных клеток, далее с помощью специальных ферментов «превратил» эти копии вновь в «двухцепочечную» материнскую ДНК и разрезал её «ферментативными ножницами» на фрагменты. Одновременно из бактерий надо было выделить плазмиды и разрезать их при помощи тех же «ферментативных ножниц». Затем в разрезанные кольца ДНК плазмид с помощью «склеивающих» ферментов вставлялись фрагменты ДНК кровяных клеток человека с самыми различными приказами. Преобразованные таким образом бактериальные плазмиды содержали теперь дополнительные приказы о построении тысяч различных белков человека.

После этого Вейссман и его коллеги вновь ввели в бактерии изменённые плазмиды. Вся эта работа требовала уйму времени и усилий. Бактерии были размножены на поверхности твёрдых питательных сред. Возникло примерно 20 000 различных бактериальных колоний, каждая содержала клетки с другими новыми плазмидами. Не могла ли одна из этих колоний иметь плазмиды, несущие информацию для синтеза интерферона человека? Эта колония бактерий могла бы выделять интерферон. Началась кропотливая работа, поиск «иголки в стоге сена».

И вот к рождеству 1979 г. профессор Вейссман сделал себе наилучший долгожданный подарок: он нашёл те бактериальные колонии, которые продуцировали человеческий интерферон! Экстракт из этих бактерий защищал клетки человека от поражения вирусами. Отныне была открыта дорога для создания первого лечебного средства против вирусных заболеваний.

Интерферонпродуцирующие бактерии были «размножены» в биореакторах. Их потомство также несло в своём наследственном материале приказ вырабатывать человеческий интерферон. В настоящее время интерферон применяется уже повсеместно во всём мире. Он эффективен против бешенства, инфекционного гепатита (желтухи), а также против различных «видов» ринитов (насморка), обусловленных вирусами. Идёт также тщательная проверка ряда сообщений относительно того, что определённые интерфероны могут с успехом применяться и против некоторых злокачественных опухолей (рака).

Что же лежит в основе генной инженерии? Из ДНК млекопитающего с помощью ферментов рестриктаз вырезают фрагмент, содержащий инструкцию для построения определённого белка (ген). Одновременно из бактерии извлекают малую кольцевую ДНК (плазмиду) и разрезают её при помощи тех же рестриктаз. Посредством клеющих (сшивающих) ферментов (лигаз) ДНК млекопитающего встраивается в бактериальную ДНК. Реконструированная плазмида вновь включается в бактериальную клетку. Там наряду с прежними инструкциями содержится и приказ бактериальной клетке синтезировать белок млекопитающего. Бактериальная клетка, претерпевшая генно-инженерные трансформации, «слепо» исполняет теперь новый приказ.