Текст книги "Гены и развитие организма"

Автор книги: Александр Нейфах

Соавторы: Елена Лозовская
сообщить о нарушении

Текущая страница: 9 (всего у книги 17 страниц)

2. Трансплантация ядер и гибриды соматических клеток

Изучение половых гибридов животных ограничено тем, что в цитоплазму яйца попадают ядра только в одном состоянии – ядра сперматозоида и что это обычно ядра достаточно близких видов. Новые возможности для исследования ядерно-цитоплазматических взаимоотношений открыли опыты по инъекции в цитоплазму ооцитов или зрелых яиц амфибий ядер различного происхождения. В этих опытах экспериментатор имеет в своем распоряжении два вида цитоплазмы: из ооцитов, в которых происходит активный синтез РНК, но не ДНК, и из активированных яиц, в которых синтеза РНК нет, но активно синтезируется ДНК. Ядра могут быть изолированы на различных стадиях развития и из разнообразных тканей: от бластулы, когда идет активный синтез ДНК и еще нет синтеза РНК, и до нервных клеток, где синтеза ДНК уже нет.

Трансплантации такого рода показали полную зависимость поведения ядер от цитоплазмы: в ооцитах синтез ДНК во всех трансплантированных ядрах быстро прекращался и начинался синтез РНК. Наоборот, в ядрах, помещенных в цитоплазму зрелых яиц, прекращался синтез РНК и начиналась репликация ДНК. Изменялся и состав синтезируемых РНК: при пересадке в ооцит ядер из взрослых тканей другого вида амфибий прекращался синтез тех РНК, которые транскрибировались до трансплантации, и начинался синтез мРНК (и соответственно белков) ооцита, но РНК и белков, свойственных тому виду, чьи ядра были использованы.

Иной подход был использован при получении гибридов соматических клеток в условиях культуры тканей. Если в один сосуд для культуры тканей поместить два вида клеток и добавить туда же агент, обратимо повреждающий их оболочки, часть клеток сольется друг с другом. Слияние клеток происходит случайно, но с достаточной частотой сливаются две (или больше) различные клетки, в результате чего образуется клетка с разными ядрами – гетерокарион. В таких гетерокарионах можно наблюдать взаимоотношения разных ядер и влияние веществ из цитоплазмы одного типа клеток на ядра другого типа.

Гетерокарионы часто вступают в митоз одновременно, хромосомы при этом смешиваются и после деления образуются две одноядерные клетки (синкарионы), содержащие хромосомы обоих типов клеток. Такие клетки продолжают делиться и дают начало клонам соматических гибридов. Если для гибридизации использованы клетки разных видов животных, то обычно в ходе последующих делений часть хромосом постепенно утрачивается (элиминируется, как у отдаленных половых гибридов) и возникают клоны клеток, содержащие весь хромосомный набор одного вида и лишь несколько или даже одну хромосому другого вида. Это дает возможность исследовать функцию генов одной или немногих хромосом.

Для того чтобы выяснить, чем регулируется в клетке синтез ДНК, были получены гетерокарионы из двух клеточных линий, отличающихся по длине предсинтетического периода – G₁ и периода синтеза ДНК – S. Оказалось, что в гетерокарионе синтез ДНК начинается одновременно в обоих ядрах, подчиняясь тому ядру, которое вступило в S-период раньше. Это означает, что в цитоплазме клеток в конце G₁-периода появляется некое вещество, стимулирующее начало репликации. Однако продолжительность S-периода в каждом из ядер гетерокариона осталась прежней, свойственной каждой исходной линии, – этот признак, следовательно, зависит от каких-то особенностей структуры хромосом, а не от цитоплазмы.

При слиянии интерфазной и делящейся клеток в интерфазном ядре начинается преждевременная конденсация хромосом и разрушение ядерной мембраны аналогично тому, что происходит в начале митоза. В этом случае очевидно, что перед началом деления клетки в ней появляются особые факторы (белки), вызывающие спирализацию (конденсацию) хромосом и растворение ядерной мембраны.

Хариссом были получены гетерокарионы между крупными опухолевыми клетками человека линии HeLa и куриными эритроцитами, мелкие ядра которых неактивны. Попадая в окружение цитоплазмы активных клеток, эти ядра разбухают, в них входят ядерные белки человека и начинается синтез различных ГНК. В результате в таком гетерокарионе синтезируются куриные ферменты и белки мембран. В конце концов в этих ядрах начинается синтез ДНК, происходит митоз и образование одноядерных клеток, при делении которых хромосомы кур быстро утрачиваются. На этом примере видно, что при слиянии клеток с активными и неактивными ядрами происходит стимуляция синтезов РНК и ДНК в неактивном ядре, а не подавление этих процессов в активном. Отсюда следует важный вывод о том, что регуляция синтеза нуклеиновых кислот обычно осуществляется позитивно, т. е. с помощью активирующих, а не подавляющих веществ. Дальше мы увидим, однако, что это не общее правило.

При гибридизации клеток человека и хомячка или человека и мыши и длительном перевивании гибридов происходит элиминация хромосом человека, так что в итоге остаются одна – три человеческие хромосомы. Как и у многих отдаленных половых гибридов, это происходит, по-видимому, из-за некоторого несоответствия между нитями веретена и хромосомами или из-за нарушения репликации. Так как процесс элиминации в значительной степени происходит случайно, то возникают синкарионы с различными хромосомами человека, оставшимися в ядре. Это позволяет, используя селективные среды с теми или иными предшественниками биологически важных молекул и ингибиторами, блокирующими пути их синтеза, создавать искусственные условия для размножения только тех клеток, в которых сохранилась не любая, а определенная хромосома человека (их можно отличить друг от друга по размерам, форме и характеру окрашивания). А далее можно выяснить, какие белки человека синтезируются в гибридных клетках, и тем самым определить, какие гены находятся в каких хромосомах, т. е. картировать геном человека.

Может быть, наиболее интересная проблема, которую позволяют изучать соматические гибриды, – это механизмы включения и выключения генов. Однако до сих пор, несмотря на большие усилия, в этом направлении получены лишь отдельные результаты. Так, оказалось, что часто гибридные клетки – синкарионы, пройдя через много клеточных делений, сохраняют активность тех генов, которые были активны в родительских клетках перед гибридизацией. В гибридах клеток, например, крысы и мыши или даже человека и мыши продолжается синтез многих ферментов обоих видов. Ho в других случаях в гибридах работа одного из активных ранее генов подавляется. Так, например, клетки мышиной опухоли меланомы синтезируют черный пигмент – меланин, а другой вид клеток (L-клетки) его не синтезирует. При гибридизации этих клеток синтез меланина прекращается, хотя в синкарионе сохраняются хромосомы обоих типов клеток.

Клетки печени в ответ на действие стероидных гормонов резко увеличивают активность одного из ферментов – тирозинаминотрансферазы (ТАТ). При гибридизации печеночных клеток крысы с фибробластами человека способность к такой стимуляции гормоном утрачивается. Однако после ряда делений эти гибриды теряют Х-хромосому человека, и сразу после этого способность гибридных клеток реагировать активацией TAT на действие гормона восстанавливается. Этот опыт позволяет сделать два важных заключения. Во-первых, одни гены могут подавлять активность других генов. В данном случае даже известно, что этот подавляющий ген находится в Х-хромосоме. А во-вторых, оказывается, что стабильная способность к стимуляции гормоном, свойственная клеткам печени, может сохраняться как бы в «скрытом» виде, никак не проявляясь в течение многих клеточных поколений. Ho как только исчезает (с Х-хромосомой человека) подавляющий ее ген, она восстанавливается снова. Подробнее вопрос о механизмах сохранения дифференцировки в ряду клеточных поколений, т. е. об эпигенетической наследственности, мы обсудим в одной из последующих глав.

В некоторых случаях гибридизация приводит к активации генов. Об общей активации генной активности в ядрах куриных эритроцитов после их гибридизации мы уже говорили. Ho вот еще один пример. Клетки печени (и опухоли печени – гепатомы) синтезируют сывороточный альбумин. При гибридизации клеток гепатомы крысы с различными непеченочными клетками мыши или человека (фибробласты, лейкоциты и др.) у гибридов начинается синтез сывороточного альбумина, и не только крысы, но и соответственно мыши или человека. Очевидно, тот фактор, который активирует ген альбумина в печени крысы, действует и на соответствующие гены мыши и человека.

Техника гибридизации соматических клеток в последние годы дополнилась также новыми методами, позволяющими комбинировать ядра и цитоплазму из различных клеток и создавать различные варианты «реконструированных» клеток. Все эти методы получили название «клеточной инженерии». Однако они не привели пока еще к принципиальным открытиям, позволяющим понять механизмы включения генов и дифференцировки.

Развитие полноценной лягушки из ядра дифференцированной клетки (A)

Неоплодотворенное яйцо (1) облучают ультрафиолетом (2) для того, чтобы убить его собственное ядро. У большого головастика (3) выделяют кусочек кишечника (4), диссоциируют его эпителий на отдельные клетки (5) и ядро одной из них (6) пересаживают в безъядерное яйцо (7). Часть таких яиц не развивается совсем (8), часть образует уродливых зародышей (9), но из небольшой части образуются нормальные головастики (10), из которых вырастают нормальные лягушки (11)

Схема гибридизации соматических клеток (Б)

Клетки разных тканей одного или разных видов при помощи факторов, повреждающих мембрану (инактивированный вирус Сендая, полиэтиленгликоль и т. д.) сливают друг с другом, получают клетку, содержащую ядра обоих типов – гетерокарион. В ходе клеточного деления хромосомы обоих ядер образуют одно общее ядро и создают гибридную клетку – синкаркон, которая может стать родоначальницей клона гибридных клеток. В ходе дальнейших делений хромосомы одного вида могут постепенно теряться

3. Химеры животных

Техника получения химерных, или, как их еще называют, аллофенных, зародышей сейчас лучше всего освоена на млекопитающих. Этому способствует отсутствие у них ооплазматической сегрегации и, следовательно, полное равенство всех клеток на ранних стадиях. Два зародыша на стадиях двух – восьми бластомеров, извлеченных из мышей разных генетических линий (часто используют линии с разной окраской шерсти), помещают в капельку питательной среды и сближают друг с другом, так что они сливаются в один зародыш. Затем химерный зародыш переносят в матку третьей мыши, в которой и происходит его развитие. В большом проценте случаев из таких составных зародышей развиваются и рождаются совершенно нормальные мышата, состоящие из клеток двух линий. Если эти линии различались по окраске шерсти (например, черные и белые), то шкурка этих мышат будет содержать полосы черного и белого цвета.

Другой способ получения химер называется инъекционным. В этом случае используют более поздний зародыш, содержащий около ста клеток и представляющий собой полый пузырек – бластоцисту, в которой только несколько клеток – зародышевый узелок или внутренняя клеточная масса – дадут начало самому эмбриону. В такую бластоцисту инъецируют клетки зародыша другой линии. Часть этих клеток прилипает к зародышевому узелку и включается в состав развивающегося эмбриона.

При обоих методах клетки двух линий мышей распределяются в зародыше совершенно случайно, и поэтому полосы разного цвета у химерных мышат располагаются также случайно. Тем не менее американской исследовательнице Минц удалось при изучении сотен таких мышат показать, что в распределении полос того или иного цвета по шкурке есть некоторая закономерность. Существенно уже то, что окраска образует полосы, а не пятна или точки. В черный или белый цвет может быть окрашена та или иная из 17 поперечных полос, причем отдельно для правой или левой стороны головы, для спины и хвоста, т. е. всего таких полос может быть 34. Каждая из этих полос может быть белой или черной с равной вероятностью. Легко подсчитать, что в этом случае из десятков аллофенных мышат трудно встретить двух одинаково окрашенных.

Из этих опытов Минц сделала важный вывод о том, что в тот момент развития, когда пигментные клетки детерминировались, их было всего 34. Далее каждая из них в результате ряда делений образовала популяцию пигментных клеток, которые перемещались очень ограниченно, только вдоль узкой зоны кожи, идущей от хребта к животу, и каждая из них определила окраску одной полосы. Однако провести такой же анализ клеток пигментного эпителия глаза оказалось невозможно: в ходе развития черные и неокрашенные клетки перемешиваются и группу пигментированных клеток нельзя считать потомством одной первично-детерминированной клетки. Опыты с химерами позволили получить и другие интересные данные, хотя их интерпретация не всегда может быть однозначной.

Пол восьмиклеточных зародышей в момент их слияния друг с другом неизвестен, и поэтому в 50 % случаев возникают химеры, состоящие из смеси женских клеток с двумя Х-хромосомами (XX) и мужских клеток с половыми хромосомами (XY). Оказалось, что чаще, хотя и не всегда, пол таких химер мужской, причем нередко возникают гермафродиты, у которых одна половая железа мужская, а другая – женская. Можно думать, что пол железы определяется случайно возникающим соотношением в ней клеток с XX– и XY-генотипами, причем XY-клетки оказывают более сильное влияние.

У химерных мышей в крови присутствуют эритроциты обеих линий, но оказалось, что доля эритроцитов одной из линий мышей (С57В1) всегда больше, чем другой (СЗН). Очевидно, способность кроветворных клеток к размножению у разных линий мышей различна. Зато в печени у этих химер преобладают клетки линии СЗН.

Кровь химерных мышей содержит лимфоциты обеих линий, которые толерантные (совместимы) с тканями обеих линий. Это означает следующее: кусочки кожи линии С57В1, пересаженные на тело мыши СЗН, быстро отторгаются. He толерантны и обратные пересадки с СЗН на С57В1. Ho кусочки кожи обеих «родительских» линий мышей хорошо приживаются на химерных мышах, полученных из этих двух линий. Мы вернемся к вопросу о тканевой совместимости в главе об иммунитете.

Очень интересны химеры в отношении их способности к образованию опухолей. Так, линия мышей АКР отличается высокой частотой опухолей лимфатической ткани – лимфом, а линия СЗН – опухолей печени – гепатом. У химер между этими линиями возникают и те и другие опухоли, причем лимфомы всегда образуются из клеток АКР, а гепатомы – из СЗН. Создается впечатление, что опухоли возникают совершенно автономно от остального организма и определяются только генотипом клеток. Однако если получать химеры различных высокораковых линий с низкораковой линией СВА, то частота образования опухолей заметно снижается. Механизм этого важного явления пока непонятен.

Особо следует остановиться на опытах с инъекционными химерами, когда в бластоцисту вводили клетки особой опухоли – тератокарциномы. Эту опухоль можно получить искусственно, если пересадить нормальный зародыш какой-либо линии мышей под кожу взрослой мыши и потом регулярно переносить растущий трансплантат от мыши к мыши. В результате возникает тератокарцинома – перевиваемая опухоль, в центре которой находятся быстро размножающиеся недифференцированные клетки, а по периферии образуются участки самых различных дифференцированных тканей. Но при инъекции в бластоцисту центральной части такой опухоли ее клетки входят в состав зародыша и перестают быть опухолевыми. Они ведут себя как обычные химеры, т. е. становятся нормальными клетками различных органов взрослой мыши. Вероятно, это первый пример того, как опухолевые клетки под влиянием эмбриональных тканей превращаются в нормальные клетки организма. Однако потомство с генотипом опухолевой линии от этих химерных мышей получить пока не удалось. Клетки тератокарциномы, являясь опухолевыми, сохраняют большие потенции и могут дифференцироваться во многих направлениях, но способность образовывать нормальные половые клетки ими, вероятно, все же утрачивается. Особые химеры были получены в нашей стране Н. Г. Хрущовым. Облученной мыши, чьи кроветворные клетки были убиты, в кровяное русло вводили клетки костного мозга или селезенки крысы. У мыши образовывались кроветворные колонии крысиных клеток. Их судьбу и дальнейшие превращения было легко проследить благодаря особенностям мышиных и крысиных клеток, легко различимым под микроскопом.

У дрозофилы химеры создаются при инъекции эмбриональных ядер одной линии мух в оплодотворенное яйцо другой линии, имеющее свои ядра. Судьба инъецированных ядер зависит от места их введения. На заднем конце яйца они становятся половыми клетками. В других частях яйца они попадают в ту или иную область поверхностной цитоплазмы и соответственно образуют клетки, входящие в состав тканей личинки или взрослой мухи. При этом они сохраняют отличительные особенности своей генетической линии. Сходный результат получают и при инъекции в яйцо ядер из некоторых многократно перевиваемых культур клеток дрозофилы, но половые клетки при этом не образуются. Очень важно, что при некоторых обстоятельствах клетки еще не теряют способности к дифференцировке, но уже не могут образовать половые клетки. Это заставляет взглянуть на зародышевый путь не как на полезную абстракцию, а как на определенную реальность.

В этой главе мы старались показать, как различные способы гибридизации создают комбинации двух генотипов и цитоплазмы или комбинации клеток с разными генотипами. Возможности, которые открывают эти методические подходы, еще не исчерпаны, и работа в этих направлениях (особенно с соматическими гибридами и с химерами) активно продолжается. Гибридизация животных и растений уже привела к огромным практическим достижениям в получении новых пород и сортов. Можно ожидать, что и методы «клеточной инженерии» дадут не только важные теоретические, но и чисто практические результаты.

Слияние ранних зародышей приводит к появлению аллофенных мышей (химер)

Эмбрионы мышей разных линий (например, с черной и белой окраской) на стадии восьми клеток извлекают из материнских организмов, освобождают от оболочек и сближают. При этом образуется один зародыш смешанного происхождения. Его пересаживают в третью мышь – «мать-воспитательницу», которая и рождает химерных мышат

Глава VIII
Манипуляции с молекулами

В предыдущих главах мы неоднократно говорили о роли ДНК, о функции генов, о синтезе РНК как о первом этапе реализации генетической информации. Почти во всех случаях об этих молекулярных процессах судят, не видя самих молекул, фактически не дотрагиваясь до них. В лучшем случае синтез РНК или белка определяют по скорости включения в эти вещества их радиоактивных предшественников – нуклеотидов или аминокислот. В этой главе речь пойдет об опытах, Которые проводят почти исключительно в пробирках с чистыми препаратами ДНК и РНК, выделенными из клеток. Если исследование скорости синтеза макромолекул фактически заканчивается их выделением, то в работах, которые мы здесь обсудим, исследования с этого только начинаются.

При нагревании ДНК выше 80–90° водородные связи, соединяющие комплементарные пары нуклеотидов друг с другом, разрываются и двойная спираль ДНК распадается на две одиночные нити. Это называется денатурацией ДНК. Если теперь несколько понизить температуру раствора и поддерживать ее такой достаточное время (это называется отжиг), то водородные связи между отдельными комплементарными основаниями (А и Т, Г и Ц) будут возникать снова. Однако устойчивая двойная спираль ДНК образуется лишь в том случае, если эти связи восстановятся на достаточно большом протяжении молекулы, т. е. если случайно встретятся две одиночные нити, комплементарные друг другу. Это называется ренатурацией ДНК.

Ренатурация происходит с тем большей скоростью, чем выше в растворе концентрация комплементарных друг другу отрезков ДНК. Поэтому если ренатурация происходит быстро, то данная последовательность ДНК представлена в геноме большим числом копий. И наоборот, если какая-то последовательность нуклеотидов редка и составляет лишь небольшую долю всей ДНК, то и случайная встреча двух таких комплементарных нитей происходит редко, а ренатурация такой уникальной ДНК будет идти очень медленно. Так, по скорости ренатурации можно судить о том, как часто представлены в геноме те или иные гены.

Одиночная нить ДНК может связываться водородными связями и с комплементарной ей нитью РНК, образуя гибридную ДНК-РНКовую молекулу. Естественно, что комплементарными ДНК могут быть только те РНК, которые ранее были транскрибированы с нее или с точно такой же ДНК. Это позволяет исследовать, какая часть ДНК участвует в синтезе РНК и, наоборот, какие виды РНК присутствуют в клетке на разных стадиях развития или в разных тканях организма.

Манипуляции с молекулами нуклеиновых кислот стали особенно разнообразными и эффективными после того, как появились методы генной инженерии. С их помощью удалось обнаружить в эмбриональных клетках слабую активность многих тысяч генов, которые до того считались «молчащими», а также подсчитать количество копий различных мРНК, и в том числе мРНК для некоторых отдельных белков. Эти данные заставляют сейчас по-новому пересмотреть многие, казалось бы уже устоявшиеся, представления.