Текст книги "Гены и развитие организма"

Автор книги: Александр Нейфах

Соавторы: Елена Лозовская
сообщить о нарушении

Текущая страница: 15 (всего у книги 17 страниц)

5. Скорость трансляции

В синтезе белка участвуют десятки компонентов: мРНК, рибосомы, ГТФ, восемь различных факторов инициации трансляции, факторы элонгации и терминации, более 40 аминоацил-тРНК и образующие их (столько же) тРНК, АТФ, 20 разных аминокислот и 20 аминоацил-тРНК-синтетаз. Существует некоторое оптимальное соотношение между количеством всех этих компонентов. Даже небольшая нехватка любого из компонентов должна уменьшать скорость трансляции. Одни компоненты, по-видимому, всегда присутствуют в достаточных количествах и никогда не становятся лимитирующим звеном. Другие же, напротив, обычно находятся в клетке в низкой концентрации, и то одна, то другая из них ограничивает скорость синтеза белка.

Вместе с тем клетка должна иметь некоторые «излюбленные» звенья, через которые скорость трансляции регулируется чаще всего и на которые «выходят» многие регуляторные внутриклеточные связи. Одним из таких звеньев является фактор инициации – elF-2. Он может находиться в двух состояниях – фосфорилированном и нефосфорилированном (неактивном и активном). Существует специфический фермент – протеинкиназа, которая фосфорилирует elF-2, и фосфатаза, которая его дефосфорилирует. Как показал С. Очоа, именно таким путем происходит регуляция синтеза белка при многих очень различных ситуациях: синтез глобина в зависимости от присутствия гема; активация синтеза белков при пробуждении развития у высохших зародышей солоноводного рачка артемии, после попадания их в воду; замедление синтеза при действии интерферона и т. д. При других ситуациях «узким звеном» становится другой фактор инициации, например elF-3.

Факторы инициации являются, таким образом, характерными точками регуляции, но в принципе им может стать любое недостающее звено. В первую очередь таким звеном могут быть компоненты, поступающие в клетку извне, – некоторые аминокислоты и источники энергии – фосфорилированные нуклеотиды (АТФ и ГТФ). У бактерий, которые очень часто оказываются в условиях белкового или энергетического голодания, существуют специальные механизмы остановки синтеза белка. В клетках многоклеточных такая ситуация возникает, вероятно, реже, но и они могут оказаться в условиях, не способствующих максимальному синтезу белка, т. е. росту.

Перечисленные выше механизмы регуляции синтеза белка неспецифичны; они в равной степени должны замедлять или ускорять синтез всех белков. Однако существуют механизмы регуляции, действующие избирательно, т. е. подавляющие синтез одних белков больше, чем других. Один из таких известных сегодня механизмов – это регуляция посредством состава тРНК. Дело в том, что включение в белок почти каждой аминокислоты может, как мы знаем, кодироваться не одним, а двумя, четырьмя и даже шестью разными триплетами. Во многих случаях для этого необходимы различные тРНК. В то же время количество разных изоакцепторных (несущих одну аминокислоту) тРНК в клетке неодинаково, и та из них, которой меньше, может стать «узким звеном», или, как говорят англичане, «горлышком бутылки».

В то же время в генах и соответственно в мРНК одна и та же аминокислота может быть закодирована часто используемым кодоном, для которого соответствующие тРНК находятся в клетке в избытке, а также редким кодоном, который хотя и кодирует ту же самую аминокислоту, но встречается в генах редко. Для такого кодона нужна особая тРНК, и если ее концентрация в клетке мала, синтез данного белка по отношению к другим белкам будет замедляться.

Судя по тому, что количественное соотношение разных тРНК в различно дифференцированных клетках неодинаково, клетки приспособлены к тем мРНК, которые в них преимущественно транслируются. Например, при дифференцировке шелкоотделительной железы у гусеницы шелкопряда в ней увеличивается концентрация тех тРНК, триплеты которых чаще используются при кодировании фиброина (белка шелка). Ho может быть и другая ситуация, когда нехватка каких-то тРНК позволяет клетке замедлять синтез некоторых белков и этим поддерживать скорости синтеза разных белков в оптимальном соотношении.

Однако существуют и другие, неизвестные пока механизмы регуляции трансляции, которые как-то стимулируют синтез одних белков и, напротив, препятствуют образованию других. Один пример такой регуляции, на уровне трансляции, мы обсудим в последнем разделе этой главы.

6. Тепловой шок – модель для изучения регуляции на многих уровнях

В заключение этой главы мы рассмотрим один особый случай, который может служить иллюстрацией для почти всех предыдущих разделов. Этот пример показывает, что, вероятно, всегда экспрессия генов регулируется не одним механизмом и не на одном уровне, а более сложным путем с вовлечением всех путей регуляции в клетке.

Речь идет о характерных изменениях состава синтезируемых белков, которые происходят при попадании организма в условия повышенной, сублетальной температуры, или, иначе, теплового удара, а по-английски – «хит-шока». Этот процесс был открыт и лучше всего изучен на личинках дрозофилы, где смену работающих генов можно наблюдать визуально благодаря появлению или исчезновению пуфов на политенных хромосомах.

Если личинку дрозофилы из оптимальной температуры 25 °C перенести в повышенную температуру, например 37°, у нее наступает «хит-шок». Он выражается в том, что в течение нескольких минут меняется состав работающих генов в слюнных железах, а также и во всех других тканях личинки. У них активируется несколько генов, которые называют генами теплового шока. Все остальные гены, работавшие при нормальной температуре, в начале «хит-шока» выключаются. Соответственно этому начинается и синтез особых белков «хит-шока», которые, очевидно, защищают личинку от высокой температуры. Синтез же всех старых белков (за исключением гистонов) при этом быстро прекращается: прерывается их трансляция.

Феномен «хит-шока» во многом остается непонятным. Неясно, в частности, каков конкретный механизм действия повышенной температуры на активность генома. Дело в том, что эти же гены можно активировать не только нагреванием, но и действием некоторых веществ, в особенности тех, которые нарушают дыхание. Среди них, однако, есть и витамин B6, с дыханием непосредственно не связанный.

Пуфы образуются в ядрах, а вызывает их появление нагревание цитоплазмы. Нагревание изолированных ядер к появлению пуфов «хит-шока» не приводит, а помещение ненагретых ядер в цитоплазму из прогретой клетки сразу вызывает в ней исчезновение старых и появление новых пуфов. Даже добавление к ядрам только прогретых митохондрий уже достаточно для стимуляции «хит-шока».

В соответствии с новыми пуфами в нагретых клетках прекращается синтез старых видов РНК (кроме рибосомных и транспортных) и начинается синтез новых. За первые несколько минут в новые пуфы перемещается большая часть молекул РНК-полимеразы II. Через 20–30 мин размер новых пуфов и интенсивность транскрипции в них достигают максимума. Одни пуфы работают сильнее, а другие слабее. Ho эти соотношения зависят от температуры: при 33° сильнее работают одни гены, а при самой высокой (37°) – другие.

Пожалуй, самые загадочные явления при «хит-шоке» происходят в цитоплазме. Всего в течение немногих минут прекращается трансляция тех белков, которые синтезировались в клетке до «хит-шока», а освободившиеся рибосомы используются для синтеза новых, теперь уже «хит-шоковых» белков. Как это происходит, остается непонятным, так как старые мРНК не деградируют, а сохраняются в цитоплазме. По-видимому, аппарат синтеза белка после прогрева как-то начинает отличать одни мРНК от других и отдает предпочтение немногим видам мРНК «хит-шока». В белоксинтезирующей системе in vitro, полученной от прогретых клеток, рибосомы транслируют преимущественно мРНК теплового шока, в то время как в такой же системе, но из непрогретых клеток одинаково транслируются и те и другие.

Функция белков «хит-шока» не очень понятна: большая их часть после синтеза мигрирует в ядра. Можно думать, что при их участии происходит подавление синтеза РНК на других генах и осуществляется какая-то защита уязвимых частей клетки от перегревания. После снятия «хит-шока» синтез РНК на ранее активных генах возобновляется.

Обнаружена и мутация, которая нарушает способность мух отвечать на действие повышенной температуры. Естественно, что такие мухи более чувствительны к нагреванию и погибают при тех температурах, которые с помощью белков «хит-шока» переносят нормальные мухи. Оказалось также, что у этих мутантов гены «хит– шока» включаются нормально, но белки «хит-шока» образуются в гораздо меньшем количестве. Создается впечатление, что у этих мутантов как-то нарушается процессинг «хит-шоковых» РНК.

Система «хит-шока» обнаружена не только у дрозофилы, а почти у всех исследованных животных и растений, в том числе и у теплокровных. По-видимому, мы имеем здесь дело с каким-то общим и древним механизмом. Об этом, в частности, свидетельствует и сходство «хит-шоковых» белков у далеких друг от друга групп животных.

На примере приспособительной реакции организма на повышение температуры среды мы встречаемся с разнообразными механизмами регуляции экспрессии генов. Здесь и внешние к клетке, и внутренние факторы, которые способны включать одни гены и выключать другие (это называется позитивная и негативная регуляция). Поскольку существует мутация, нарушающая процессинг «хит-шоковых» РНК, этот этап реализации генетической информации также имеет свою систему регуляции. При «хит-шоке» образуются некоторые новые РНК, которые, однако, не выходят из ядер. На примере «хит-шока» обнаруживается возможность очень тонкой регуляции трансляции. Это не просто ее ускорение или замедление и даже не ускорение трансляции одних РНК по сравнению с другими. Здесь происходит необычный процесс – избирательное прекращение трансляции одних матриц и включение трансляции других. Чем глубже исследуется эта в общем-то исключительная ситуация, тем большие подробности о механизмах регуляции экспрессии генов становятся известными. При тщательном исследовании многих явлений в организме мы как бы случайно открываем возможность подойти почти ко всем механизмам, действующим в клетке, а часто и обнаружить такие, которые ранее не были известны.

Несмотря на то что регуляция экспрессии генов у эукариот изучается давно и многими научными коллективами, успехи науки в этом направлении довольно скромны. Они несравнимы с тем, как много мы знаем о механизмах регуляции работы генов у прокариот и особенно у вирусов. Дело здесь в том, что по мере повышения организации – от вирусов к бактериям, от бактерий к низшим эукариотам и от тех к многоклеточным – в еще большей степени возрастает сложность систем управления. Это усложнение носит качественный характер: добавляются новые механизмы и новые принципы регуляции. Поэтому было бы неверно думать, что исследователи вирусов и бактерий работали хорошо, а исследователи животных – хуже. Просто перед ними стояли несравнимые по сложности задачи. Впрочем, надо признать, что доступность прокариот привлекла к ним лучшие научные силы и большие средства. Сейчас успехи изучения регуляции экспрессии генов у эукариот стали намного ощутимее. В первую очередь это относится к проблеме строения промоторов (энхансеров) и их положения относительно структурного гена. Ho еще более впечатляют успехи в изучении такой старой, сложной и важной проблемы, как механизм малигнизации – злокачественного перерождения клеток. В заключение главы мы кратко коснемся этой темы.

В последние годы работами американских, английских и шведских ученых было показано, что процесс преобразования нормальной клетки в раковую проходит в два этапа, каждый из которых контролируется своими генами и вызывается своими причинами. Известно, что клетки, пока они нормальны, могут пройти лишь несколько десятков делений (см. гл. XIV). Ho под влиянием вирусов или изменений в собственных хромосомах некоторые клетки каким-то образом теряют тот контрольный механизм, который ограничивает число их делений. Такие клетки могут делиться бесконечное число раз, то есть становятся «бессмертными». В культуре ткани или в организме приобретение «бессмертности» происходит неоднократно, хотя и редко. Ho само по себе это свойство еще не означает злокачественности. Для ее возникновения необходим второй этап – значительное увеличение активности одного из онкогенов. Так называют некоторые нормальные гены клетки из-за их способности в исключительных ситуациях вызывать рак. Для возникновения этой ситуации необходимо, чтобы в одной из клеток, прошедших первый этап, произошло такое редкое событие, как попадание активного промотора в район онкогена. Это может возникнуть, например, при случайной хромосомной перестройке или включении в геном вируса. Активация онкогена в уже трансформированных клетках приводит к ненормальному увеличению количества того белка, который этим геном кодируется. Такая одиночная клетка, пока непонятно почему, становится злокачественной – она быстро и бесконтрольно делится и дает начало клону клеток, образующих опухоль.

То, что благодаря успехам в изучении строения и функции генов мы приблизились к пониманию механизмов возникновения рака делает более перспективной и борьбу с ним.

Глава XIV
Как в развитии создается форма

Форма, возникающая в развитии, – форма целого организма, форма органа или форма клетки – это такой же важный признак организма, как и его биохимические свойства. Ho создание формы – значительно более сложный процесс. Это очевидно уже потому, что образование формы (морфогенез) складывается из многих отдельных молекулярных событий – синтеза специальных белков и химических процессов, происходящих при участии этих белков.

Мы уже знаем, что синтез одного простого белка кодируется одним геном, образование сложных белков контролируется двумя или несколькими генами. Химическая реакция в клетке – уже более сложное явление. Хотя она катализируется одним ферментным белком (и соответственно контролируется одним или двумя-тремя генами), но обычно также зависит от притока исходных субстратов, скорости использования продукта реакции, от условий и структур клетки, в которых она протекает. Все это вовлекает в контроль каждого химического процесса дополнительные гены. В сложных процессах, таких, например, как синтез ДНК, участвуют, вероятно, десятки и сотни генов.

Образование же формы включает десятки различных химических реакций, взаимодействие макромолекул и низкомолекулярных веществ и соответственно предполагает контроль со стороны множества генов. Казалось бы, этому противоречат данные классической генетики: нам известны отдельные гены, определяющие у дрозофилы число щетинок, форму крыла, размер глаза и т. д. Однако в действительности каждый такой ген является лишь одним из многих генетических элементов, участвующих в контроле формы. Их мутации нарушают нормальное строение органов, но оно может быть нарушено и многими другими путями, т. е. мутациями в иных генах.

Форма клеток и форма органов – это два разных явления, которые хотя и тесно связаны, но не всегда могут быть сведены друг к другу. Образование формы клеток еще не обязательно предопределяет форму органов, а форма органов обычно создается до того, как клетки приобретут свое окончательное строение. Вместе с тем надо четко понимать, что форма органов создается только благодаря специфическому поведению клеток и никаких сил, действующих «над» клетками, вне их (имеются в виду таинственные биополя и прочая мистика), не обнаружено и, по всей очевидности, не существует. Предположение о том, что, до того как возникнут сами органы, существуют некие биополя, которые уже имеют форму органов, является удобным выходом из тех трудностей, которые реально возникают перед исследователем морфогенеза. У нас есть единственный способ понять механизмы формообразования – обходиться теми силами, которые можно обнаружить. Этими силами являются взаимодействия клеток, изменения их формы и поведения, которые и приводят к возникновению формы органов, какой бы сложной она ни была.

1. Форма клеток

Форма клеток зависит от их внутренней структуры и свойств клеточной оболочки и от их окружения – соседних клеток и поверхностей контакта. Так, при культивировании отдельных клеток на поверхности стекла все клетки стремятся распластаться по субстрату. Аналогичным образом они распластываются и па различных поверхностях внутри организма. Одни клетки при этом неподвижны и имеют округлую форму, другие двигаются и вытягивают многочисленные отростки – псевдоподии – в направлении движения.

Одни клетки «стараются» как бы избегать контактов и соприкасаются одна с другой лишь отростками. Так, например, ведут себя клетки соединительной ткани – фибробласты или, у зародыша, мезенхимные клетки. Другие клетки могут, напротив, образовывать тесные скопления, «стараясь» соприкоснуться с соседями всей своей свободной поверхностью. Таковы, например, клетки печени. Клетки могут образовывать одно– или многослойные пласты – эпителии, где они соприкасаются только боковыми поверхностями и сохраняют свободными и различными наружную и внутреннюю (верхнюю и нижнюю) поверхности. Полярность – непременное свойство каждого эпителия. Между этими крайними вариантами есть много промежуточных способов взаимного расположения клеток, что, естественно, отражается на их форме. Особо можно сказать о нервных клетках с их многочисленными короткими отростками – дендритами и одним длинным отростком – аксоном.

Внутренние структуры клетки, которые определяют её форму, называются цитоскелетом. Цитоскелет образован волокнами разного диаметра, собранными из различных специальных белков. Каждый вид волокон имеет свои механические свойства, по-своему образуется или распадается п играет свою роль в образовании формы клетки и в определении ее поведения. Кроме белков собственно цитоскелета, составляющих существенную часть клеточных белков, есть еще группа плохо изученных минорных белков, которые определяют сборку цитоскелета и поэтому более ответственны за создание клеточной формы, чем белки самого цитоскелета. О механизмах деятельности этих белков сборки мы знаем пока очень мало.

Самые крупные волокна клетки называются микротрубочками. Их наружный диаметр 25 нм (1 нм = 10^-9 м), толщина стенки 5 нм. Эти трубочки собираются из глобулярных молекул особого белка – тубулина, которые располагаются в виде плотной спирали, так что вдоль одного ее оборота умещается 13 молекул тубулина, связанных друг с другом. Микротрубочки ориентированы, и их сборка обычно происходит с одного конца, а разборка – с другого. В сборке принимают участие специальные белки в очень небольших количествах и в качестве источника энергии – ГТФ. Сборка и разборка микротрубочек происходят быстро, иногда в течение нескольких минут.

Микротрубочки принимают участие в делении клетки, образуя нити веретена, которые «растаскивают» хромосомы к разным полюсам – дочерним ядрам, Предполагается, что движение хромосомы в митозе происходит за счет разборки нитей веретена, «тянущих» хромосомы, и сборки нитей, лежащих между хромосомами и «толкающих» их в разные стороны. Микротрубочки принимают участие и в создании цитоскелета. Они являются основой структуры жгутиков и ресничек (например, у многих одноклеточных, но не только у них). В жгутиках они образуют характерный скелет, состоящий из двух микротрубочек в центре и девяти двойных микротрубочек, расположенных вокруг по периферии. Микротрубочки достаточно упруги и не могут изгибаться под большими углами. Ho в составе жгутиков и ресничек они способны к небольшим изгибам и передают механические колебания вдоль по жгутику, способствуя тем самым движению таких свободно плавающих клеток, как инфузории или сперматозоиды. Сами эти колебания создаются частичной сборкой – разборкой микротрубочек. Они играют также важную роль в организации структуры нервных клеток, составляя механическую опору аксонов.

Существуют вещества колхицин и колцемид, которые проникают в клетку и, связываясь с микротрубочками, блокируют их сборку. Этим они нарушают динамическое равновесие между сборкой и разборкой, что приводит к исчезновению микротрубочек в клетке. Колхицин блокирует митоз на стадии метафазы, т. е. подавляет те процессы, которые происходят при расхождении хромосом. Эти свойства колхицина (и колцемида) нередко используются экспериментаторами для накопления клеток, остановившихся на стадии метафазы.

Вероятно, основным видом волокон цитоскелета являются микрофиламенты. Их диаметр 6 нм, и они образованы из фибрилярного белка – актина. Актин долгое время считали специфическим белком мышц. Однако оказалось, что в клетке могут синтезироваться различные актины, отличающиеся друг от друга заменами некоторых аминокислот. Актин микрофиламентов, например, отличается от мышечных актинов по 25 аминокислотам. Сами мышечные актины тоже различны: один актин входит в скелетные мышцы, другой – в гладкие, третий – в сердечную мышцу. Все они, естественно, кодируются разными генами.

Актин микрофиламентов, по-видимому, самый обильный белок в клетке. На его долю приходится до 10 % всех клеточных белков. Локализацию микрофиламентов удается выявить с помощью антител, выработанных против актина и сцепленных с флюоресцирующим красителем. В движущихся клетках, обработанных такими антителами, можно видеть, что микрофиламенты ориентированы в направлении движения клетки. Пучки микрофиламентов подходят к плазматической мембране в тех точках, где она прикрепляется к поверхности субстрата, и участвуют в движении клетки. В делящихся клетках, когда микротрубочки осуществляют расхождение хромосом, микрофиламенты осуществляют цитокинез – деление самой клетки. Для этого они под поверхностью клетки образуют кольцо, которое, сжимаясь, перетягивает клетку пополам.

Цитохалазин – вещество, выделяемое из грибов, – блокирует образование микрофиламентов и разрушает уже образованную ими сеть. Цитохалазин останавливает движение клеток, в его присутствии клетки теряют характерную для них форму и округляются. Как и следовало ожидать, он не препятствует расхождению хромосом, но блокирует цитокинез. Это приводит к образованию двухъядерных клеток.

Предполагается, что актин микрофиламентов, как и актин в мышцах, связан с другими сократительными белками, в первую очередь с миозином. При их участии микрофиламенты осуществляют механическое подтягивание всей клетки к точке прикрепления ее отростков к субстрату. Этим они определяют ее движение.

В сборке микрофиламентов из свободных молекул актина участвуют специфические белки, присутствующие в клетке в малых количествах. Об их функции, о том, как они собирают микрофиламенты в нужное время, в нужных местах и в нужной ориентации, мы пока знаем мало.

О соотношении функций микротрубочек и микрофиламентов можно судить по действию колхицина и цитохалазина на рост аксона нервной клетки. Из тела дифференцирующейся нервной клетки вытягивается длинный аксон, на конце которого находятся многочисленные тонкие короткие отростки – микрошипики. С их помощью, вероятно, определяется направление роста аксона. При действии цитохалазина эти микрошипики исчезают и рост аксона почти прекращается, хотя сам он остается неизменным. Очевидно, что вытягивание микрошипиков осуществляется с помощью микрофиламентов. При действии же колхицина неизменными остаются шипики, но начинает укорачиваться сам аксон. Постепенно он втягивается в тело клетки целиком. Очевидно, что рост и поддержание структуры аксона определяются микротрубочками.

В клетках имеется и третий вид волокон, имеющих промежуточные размеры. В эпителии они, например, образуются из нитей кератина, в других клетках это иные белки. В целом цитоскелет клетки представляет собой сложную сеть нитей различного диаметра, белкового состава и назначения. Важной особенностью цитоскелета является его высокая динамичность – способность быстро перестраиваться в зависимости от состояния клетки и ее окружения. Когда специфичные ингибиторы блокируют сборку волокон, то уже существующие элементы цитоскелета разрушаются, что приводит к нарушению формы и поведения клетки. При удалении ингибиторов из среды волокна цитоскелета быстро восстанавливаются.

Как мы увидим ниже, цитоскелет через изменения формы клеток и их движения участвует в создании структуры тканей и формы органов, хотя они создаются не только за счет изменений цитоскелета.

Микрофиламенты и микротрубочки преимущественно ориентированы в направлении движения фибробласта

Пучки актиновых микрофиламентов (1) выявляются на препарате с помощью антител к актину, а микротрубочки (2) – с помощью антител к тубулину. К антителам присоединяют флюоресцирующее вещество. Препараты А. Д. Бершадского и В. И. Гельфанда