Сын почтмейстера. Учился в Кронштадтской гимназии и Петербургском университете, где и окончил курс по историко-филологическому факультету; был оставлен при Университете для приготовления к профессорскому званию. Занимается преподаванием истории в средних учебных заведениях, а с 1891 г. читает лекции в Александровском лицее по русской истории. Первый печатный труд Мякотина — «Крестьянский вопрос в Польше в эпоху её разделов», 1889. Для «Биографической библиотеки Павленкова» Мякотин написал биографии Мицкевича (1891) и протопопа Аввакума (1893). Важны основанные на архивных материалах, которые автор долго изучал в Киеве, Чернигове, Харькове и Москве, специальные работы: «Прикрепление крестьянства левобережной Малороссии в XVIII ст.» («Рус. Богатство», 1894) и «К истории Нежинского полка» (составленный по поручению Академии наук разбор книги А. М. Лазаревского: «Описание старой Малороссии», 1896). Участвовал в периодической прессе (в частности, «Профессор сороковых годов» [Т. Н. Грановский], «Русское богатство», 1896) и в Энциклопедическом словаре Брокгауза и Ефрона («Казачество» и мн. др. статьи по русской истории).

С 1897 по 1902 поместил ряд исторических и публицистических статей в журнале «Русское богатство». С марта 1900 по декабрь 1904 вёл «Хронику внутренней жизни» в том же журнале. В 1902 издал книгу «Из истории русского общества», в состав которой вошли разные его исторические статьи, большей частью из «Русского богатства». В апреле 1901 был арестован по обвинению в политическом преступлении и после двухмесячного тюремного заключения выслан из Петербурга, с воспрещением жить в столицах и университетских городах, а в 1903 выслан на 3 года под надзор полиции вНовгородскую губернию, где и был водворён губернатором в городе Валдае. В ноябре 1904 освобождён из-под надзора полиции и вновь вернулся в Петербург. Состоял одним из членов редакции «Русского Богатства».

8 января 1905 года, накануне событий «Кровавого воскресенья», вошёл в состав депутации из представителей интеллигенции, посетившей министров С. Ю. Витте иП. Д. Святополк-Мирского с просьбой не применять военную силу против демонстрантов. Депутация успеха не имела, и после разгона рабочего шествия, 11 января, Мякотин вместе с другими её членами был арестован и заключён в Петропавловскую крепость. Входил в либеральный «Союз освобождения», был одним из редакторов оппозиционной газеты «Сын отечества». В конце 1905 года сотрудничал в газете эсеров «Революционная Россия». В мае — июне 1906 года один из самых острых критиков Государственной думы I созыва на многочисленных митингах в Петербурге[1]. Осенью 1906 года — один из основателей Партии народных социалистов.

В 1911—1912 отбывал заключение в Двинской крепости (ныне Даугавпилс). В 1917 году избран председателем ЦК Трудовой народно-социалистической партии. В 1918один из создателей и руководителей Союза возрождения России. В 1920 арестован, содержался в Бутырской тюрьме. В 1922 выслан из России. Жил в Берлине, Праге, затем в Софии. С 1928 года преподавал в Софийском университете.