Текст книги "Металлы, которые всегда с тобой"
Автор книги: Ефим Терлецкий
сообщить о нарушении
Текущая страница: 4 (всего у книги 12 страниц)
Гемоглобин под рентгеном
Окончательная разгадка строения молекул гемоглобина и миоглобина связана с именами известных учёных Макса Перутца и Джона Кендрю, начинавших свою деятельность в знаменитой Кавендишской лаборатории Кэмбриджского. университета в Англии. Именно там был разработан, рентгеноструктурный анализ, сыгравший исключительную роль не только в исследовании кристаллов белков, но также самой, пожалуй, знаменитой молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Однако это произойдёт позже, в 50-е годы. А пока, во второй половине 30-х годов, М. Перутц, австриец по происхождению, стажируется в Кавендишской лаборатории. Его привлекал рентгеноструктурный анализ. А так как он интересовался ещё и биохимией, то обратил внимание на гемоглобин и химотрипсиы, дававшие хорошие кристаллы.
Вскоре выяснилось, что химотрипсин чрезвычайно труден для исследования, и Перутц сосредоточился только, на гемоглобине. Но и гемоглобин оказался не менее крепким орешком. Понадобилось чуть ли не 30 лет (!), прежде чем удалось установить его строение. Разумеется, Перутц на такой срок работы не рассчитывал. Однако он отдавал себе отчёт, что берётся за весьма нелёгкую задачу. Много позднее он по этому поводу не без иронии говорил: «...Когда темой своей диссертации я выбрал рентгено-структурный анализ гемоглобина, мои товарищи не могли смотреть на меня без сожаления. В ту пору самым сложным органическим вещёством, структура которого была установлена с помощью рентгеноструктурного анализа, оставалась молекула красителя фталоцианина, состоящая из 58 атомов. Как мог я надеяться выяснить расположение тысяч атомов в молекуле гемоглобина?»
В 1946 году к Перутцу присоединился армейский офицер королевских ВВС Дж. Кендрю, который после демобилизации решил посвятить себя молекулярной биологии. До войны здесь же в Кембридже, в Тринити-колледже, он блестяще окончил курс естественных наук, получив степень бакалавра, а затем и магистра (примерно соответствующую нашей кандидатской).
К приходу Кендрю результаты десятилетних усилий Перутца в исследовании гемоглобина были весьма скромными. Поэтому Кендрю выбрал себе более простой объект для экспериментов – миоглобин кашалота. Этот белок в больших количествах был найден в мышцах китов и тюленей, что и объясняет их способность долго находиться под водой. Мы уже знаем о том, что молекулы кислорода переходят от гемоглобина к миоглобину, где и хранятся надёжно, пока не потребуются клетке.
Долгие годы неудач не сломили Перутца. Он не отступил. Стало ясно, что нужно менять тактику исследований. Обычные методы рентгеноструктурной дифракции оказались недостаточными для расшифровки чрезвычайно сложной молекулы гемоглобина.
В то время руководителем Кавендишской лаборатории был У. Л. Брэгг, нобелевский лауреат, один из основателей рентгеноструктурного анализа. Естественно, что он был живо заинтересован в установлении структур белковых молекул – сложнейших в природе. Он постоянно наблюдал за ходом экспериментов и частенько захаживал в лабораторию Перутца, чтобы взглянуть на свежие рентгенограммы: Потом сэр Брэгг отправлялся домой и на досуге долго размышлял над полученными результатами.
Изготовление рентгенограммы кристалла () – лишь половина дела. Далее пятна на снимке, соответствующие определённым структурным центрам, с помощью специального оптического прибора преобразуют в ряд дифракционных полос. Затем их совмещают, и только тогда получают нечто вроде контурных карт, по которым определяют строение вещёства.
Чтобы добиться изображения, отражающего реальную структуру, нужно правильно расположить набор дифракционных полос по отношению к определённой, но произвольно выбранной исходной точке. Получая такой набор, довольно легко определить амплитуду волны. Но не её фазу! Здесь-то «зарыта собака» всей многолетней проблемы: изображений могло получиться бесчисленное множество– в соответствии с выбранной фазой для каждого ряда полос. Попробуй, угадай, какое из них правильное.
Вот как сам Перутц писал про это: «Сама по себе рентгенограмма говорит нам только об амплитудах, но ничего не говорит о фазах полос, которые даёт каждая пара пятен; таким образом, половина информации, необходимой для получения изображения, отсутствует. Из-за этого рентгенограмма кристалла оказывается иероглифом без ключа для его расшифровки. Терпеливо измеряя в течение ряда лет интенсивность нескольких тысяч пятен на рентгенограммах гемоглобина, я испытывал танталовы муки, которые может понять только исследователь, заполучивший коллекцию табличек с надписями на неизвестном языке. ...Мы с Брэггом пытались разработать методы расшифровки фаз, но не добились большого успеха».
«Золотой» миоглобин
Заветный ключик был подобран только в 1953 году. Именно тогда Перутца осенила блестящая и, в общем-то, простая идея. Он подумал о том, что не худо было бы воспользоваться методом, разработанным для расшифровки структур простых кристаллов. В этом случае к молекуле «цепляли» атомы каких-нибудь тяжёлых металлов, существенным образом менявших интенсивность дифракционных полос. Сравнивая амплитуды, которые давали молекулы с атомами металлов и без них, можно было установить разницу. Определение по ней величины фазы представлялось, как говорится, делом техники. В качестве тяжёлого металла выбрали ртуть.
«...Пока я проявлял свою первую рентгенограмму гемоглобина с введённой в его молекулу ртутью,– рассказывал Перутц,– я то предавался оптимистическим надеждам на немедленный успех, то впадал в отчаяние, перебирая в уме все возможные причины неудачи, наконец на бумаге появились дифракционные пятна – точно в тех же местах, что и в случае свободного от ртути гемоглобина, однако интенсивность их была несколько иная – что я и ожидал. Ликуя, я ворвался в комнату Брэгга, считая, что выяснение структуры гемоглобина и многих других белков уже у нас в руках. Брэгг разделил мой энтузиазм. Никто из нас в тот момент не мог представить себе те огромные технические трудности, которые задержат нас ещё на пять лет».
Дело заключалось в чрезвычайно трудоёмких вычислениях. Судите сами. Число пятен на рентгенограммах может достигать сотен тысяч. Для каждого нужно измерить интенсивность с атомами ртути и без них, затем внести поправки на различные геометрические факторы и потом, накладывая друг на друга десятки тысяч дифракционных полос, получить искомую структуру. Таким образом, приходилось оперировать многими миллионами чисел. Конечно же, без помощи ЭВМ эту работу выполнить было невозможно. И даже с её применением громоздкие расчёты заняли ещё несколько лет.
Перутц являл собой пример истинного исследователя, который ни под каким видом не сворачивал с пути и твёрдо, пусть чуть ли не ползком, продвигался к намеченной цели.
Заметим попутно, что в то же самое время, в: той же самой Кавендишской лаборатории английский физик Фрэнсис Крик, работавший над докторской диссертацией «Исследования поведения кристаллов гемоглобина в растворах солей различной плотности», и американский генетик Джеймс Уотсон, приехавший на стажировку, чтобы заняться миоглобином, буквально за два года теоретически обосновали и разработали структуру знаменитой двойной спирали – молекулы ДНК– И, как они сами говорили всерьёз, дожидались за это Нобелевской премии.
Перутц, их научный руководитель, все ещё не пришёл к окончательным результатам. Даже Кендрю почти закончил расшифровку строения молекулы миоглобина. Именно он впервые начал применять ЭВМ и, набив на этом руку, резко продвинулся вперед. Из-за некоторых особенностей работы с миоглобином ртуть была неприменима для построения структурных карт, зато вполне подошло золото.
Кендрю получил 400 рентгенограмм простого и столько же «золотого» миоглобина, затем с помощью вычислительных машин подобрал плотность молекулы при 4000 различных значений и нанес их на прозрачные карты. В 1957 году он наконец смог создать первую модель молекулы миоглобина, дававшую весьма приблизительное представление лишь о форме белковой цепи. Для окончательной расшифровки понадобилось еще 10 000 рентгеновских снимков и несколько месяцев, в течение которых шесть сотрудников обрабатывали эти данные на ЭВМ. Окончательная модель молекулы миоглобина, учитывающая расположение почти каждого атома, была построена в 1959 году.
Гадкий утёнок
Что же увидели исследователи, взглянув на творение своих рук? Скажем сразу, поначалу плоды многолетних трудов их весьма разочаровали. Получился какой-то монстр. Казалось, молекула миоглобина представляла собой клубок переплетённых и извивающихся червей. Макс Перутц, увидев ее, в сердцах воскликнул: «Неужели поиски абсолютной истины могут привести к установлению столь отталкивающей структуры, напоминающей внутренности? Неужели вместо золотого самородка нашли всего лишь свинцовую глыбу? – Затем, как бы полемизируя сам с собой и успокоившись, он закончил: – К счастью, подобно многим другим природным объектам, миоглобин выигрывает в красоте при более близком рассмотрении. По мере уточнения структуры миоглобина... стали яснее внутренние причины, объясняющие странную форму его молекулы. Эта форма оказалась не уродством, а принципиальной закономерностью, свойственной, очевидно, миоглобинам и гемоглобинам всех позвоночных» (рис. 6).
Перутц оказался тысячу раз прав: выявленная исследователями совершенно невообразимая форма молекулы миоглобина была обусловлена теми функциями, которые она должна выполнять в организме. Но об этом несколько позже. Давайте не забывать о том, что и миоглобин, расшифрованный Кендрю, и более сложный по строению гемоглобин, над разгадкой которого бился Перутц, это прежде всего белки, соединённые с гемовыми группами.
И коль скоро у нас зашёл разговор о белках, то полезно вспомнить, что они построены из множества остатков 20 аминокислот, представляющих собой как бы последовательную цепь, или, как ещё говорят, белковый текст. Его можно расшифровать химическим путём и найти таким образом первичную структуру белка. Вторичную структуру – пространственную организацию цепи аминокислотных групп определяют при помощи метода, основанного на поляризации света и получении определённых спектров. Третичную структуру – пространственное строение молекулы белка установить гораздо сложнее.
В самом деле, в нашем организме насчитывается более миллиона различных белков. Из них для 800 установлена первичная структура. Но едва лл наберётся сотня белков, пространственная структура которых известна.
Первым, кто рискнул заняться выяснением пространственной структуры белков, был один из выдающихся химиков нашего времени американский учёный Лайнус Полинг, ныне дважды заслуживший Нобелевскую премёю. Именно он в самом начале 50-х годов построил из разноцветных шариков пространственную модель полипептидной цепи и показал её спиральное строение. Эту структуру он назвал а-спираль.
Разработанная чисто теоретическим путём, такая структура вскоре подтвердилась и рентгенографически, что сыграло большую роль в нелёгкой работе Перутца и Кендрю. Более того, при ближайшем рассмотрении оказалось, что неудобоваримая форма молекулы миоглобина есть не что иное, как а-спираль, свёрнутая в клубок. А в её изгибе расположилась единственная группа гема с единственным же атомом железа.
Так миоглобин стал первым белком, молекула которого поддалась пространственной расшифровке. Она содержит около 2500 атомов и состоит из 153 аминокислотных остатков.
Летом 1959 года наступил звёздный час Макса Перутца: структура гемоглобина была, наконец, установлена, правда, ещё не совсем в окончательном виде.
Столь долгий путь был проделан недаром. Эта молекула оказалась гораздо сложнее, чем молекула миоглобина. Гемоглобин содержит почти 10 тыс. атомов и состоит из 574 аминокислотных остатков. И если у миоглобина одна полипептидная а-цепь, то у гемоглобина их две, да ещё две Р-цепи и соответственно 4 группы тема, каждая из которых содержит атом железа. Таким образом, молекула гемоглобина в 4 раза больше молекулы миоглобина.
Природа экономна. Помните – гемоглобин переносит не только кислород, но и углекислый газ. Миоглобин же лишён этой способности. Он запасает только кислород, и поэтому его молекула меньше.
Природа экономна, но она и расточительна, когда в этом есть необходимость. Подумать только: 4 атомам железа помогают .10 тыс. других атомов. Именно такое количество атомов необходимо, чтобы,4 цепи гемоглобина, изогнувшись, словно щупальца спрута, захватили своими гемовыми присосками молекулу кислорода.
В а-спирали закручена не вся белковая цепь. Некоторые участки в ней неупорядочены, и поэтому она свёртывается в глобулу – шар. В такой пространственной структуре сохраняется некоторая подвижность белковой цепи. Скажем, цепь миоглобина свёрнута примерно на 75 %. Все 4 гемоглобиновые цепи также свёрнуты в глобулу. Такие белки называют глобулярными в отличие от фибриллярных,, фигурирующих в виде волокон.
Итак, наши белки обладают способностью менять свою конфигурацию – как говорят специалисты, подвергаться конформационным изменениям. О том, что молекула гемоглобина могла подвергаться таким превращениям, догадывались давно. Ещё в 1937 году американский учёный Ф. Гауровиц, работавший тогда с гемоглобином в Праге, как-то после окончания экспериментов поставил в холодильник суспензию игольчатых кристаллов оксигемоглобина. Несколько недель спустя, натолкнувшись на забытый препарат (вспомним шведский гематит немецких исследователей) Гауровиц с интересом стал рассматривать его под микроскопом. Оказалось, что алые иголки оксигемо-глобина превратились в шестиугольные темно-красные пластинки восстановленного гемоглобина. Это случилось потому, что весь кислород в суспензии... «съели» бактерии. Пока велось наблюдение, кислород, проникший под покровное стекло микроскопа, снова вызвал появление алых иголок оксигемоглобина. Гауровиц долго размышлял над этим любопытным явлением, пока не пришёл к весьма остроумному выводу: взаимодействие гемоглобина с кислородом должно влиять на пространственную организацию белковой молекулы.
Собственно говоря, эти наблюдения в своё время и навели Макса Перутца на мысль заняться вплотную именно гемоглобином. И только через четверть века он смог вместе со своёй аспиранткой X. Мюирхед доказать, что молекула гемоглобина как бы дышит, когда присоединяет кислород. В это время её глобула сжимается. Отдавая кислород, она снова расширяется (рис. 7).
Долгие и драматические поиски структуры гемоглобина закончились вполне счастливо. В 1962 году Максу Перутцу ' и Джону Кендрю была присуждена Нобелевская премия «За исследование в области глобулярных белков». Интересно, что одновременно с ними лауреатами этой премии стали Фрэнсис Крик и Джеймс Уотсон, открывшие структуру ДНК и дожидавшиеся этой почётной награды 10 лет.
Роковая опечатка
Напрасно думать, что Нобелевская премия поставила точку в истории изучения гемоглобина, в истории 4 атомов железа. Эта история продолжается. Достаточно сказать, что ежегодно во всем мире в печати появляется около 200 научных работ, посвящённых гемоглобину. Это значит, что каждые два дня выходит новая публикация.
Существует множество различных гемоглобинов, которые отличаются друг от друга частностями. Мы не будем подробно перечислять их, памятуя, что наш рассказ все же о железе. Но совершенно невозможно умолчать о том, что даже единожды нарушенный порядок в белковой молекуле чреват большой опасностью для организма и мешает чёткой работе атомов железа.
Надо сказать, что гемоглобин интересовал не одного только Перутца. В 40-х годах им занимался и Полинг. Он задался далеко не праздным вопросом: есть ли разница между нормальным гемоглобином и так называемым гемоглобином S? Дело в том, что существует тяжёлая наследственная болезнь крови – серповидноклеточная анемия, при которой эритроциты имеют как бы серпообразную форму. В США, например, около 10 % негритянского населения являются носителями гена такой болезни. В некоторых районах Африки эта величина достигает даже 60 %.
Люди, получившие аномальный ген только от одного из родителей, не болеют. Страдают от анемии те, кто унаследовал её от обоих родителей. Обычно эти люди умирают очень рано.
Не вдаваясь в подробности, заметим, что распространение этой болезни в некоторых районах Африки, Средиземноморья и в странах Юго-Восточной Азии связано с биологическим парадоксом. Люди, у которых имеется ген сер-повидноклеточной анемии в активной или скрытой форме, не болеют малярией. А ведь малярия – страшный бич названных регионов. В серповидных эритроцитах возбудитель малярии – плазмодий не размножается.
Препятствием для размножения плазмодия является гемоглобин, точнее – то его место, где возникает «опечатка»' белкового текста. Шестое место от начала р-цепи нормального гемоглобина занимает остаток глутаминовой кислоты. При серповидноклеточной анемии в эритроцитах присутствует аномальный гемоглобин 5, шестое место р-цепи которого принадлежит другому остатку – валину. Вот и все. Один-единственный аминокислотный остаток не тот – и вся молекула перестаёт исправно выполнять свои функции. Такой аномальный гемоглобин труднее растворим, чем обычный, и выкристаллизовывается, изменяя форму эритроцита. Ущербные же эритроциты способствуют тромбозам и быстро подвергаются гемолизу – распаду. Но самое, пожалуй, страшное то, что железо в таком гемоглобине окислено до трёхвалентного и, следовательно, не способно в полной мере переносить кислород.
Полинг, сравнивая нормальный и серповидный гемо-глобины, обнаружил, что первый оказался более кислым. Это могло, по его мнению, указывать на то, что нормальная молекула гемоглобина содержит несколько больше кислых остатков в пептидных цепях. Однако методы применявшегося тогда качественного анализа не позволили Полингу обнаружить какую-либо разницу в аминокислотном составе исследовавшихся молекул.
Только десять лет спустя стало возможным перебрать почти 600 аминокислотных остатков, чтобы установить, какой же из них дефектный. Это сделал в 1959 году американский биохимик, занимающийся молекулярной биологией, Верной Ингрэм.
Поскольку перед ним не стояла задача исследования пространственной структуры белка, Ингрэм использовал довольно простой хроматографический метод. Однако он его несколько усовершенствовал, для того чтобы более определённо выявить различие в аминокислотных остатках.
Хроматография основана на разделении смесей. В данном случае Ингрэм применил хроматографию на бумаге. Скажем, если бы мы капнули смесью разноцветных чернил на промокашку, то они по-разному расползлись бы на ней. Зная «степень расползания» для чернил каждого цвета, можно легко установить их наличие в капле. Совмещая хроматограммы разных гемоглобинов, выявляют несовпадающие участки и определяют, к каким именно аминокислотным остаткам они относятся. Этот метод получил шутливое название «метода отпечатков пальцев». Однако здесь все не так просто, как в дактилоскопии. Из-за незначительного различия в строении остатков, их часто невозможно отличить даже по хроматограмме. Поэтому Ингрэм прибегнул к маленькой хитрости, поместив бумагу с исследуемым материалом в электрическое поле. Тем самым удалось ещё больше растащить аминокислоты, так как под воздействием электрического тока путь зависел ещё и от их электрического заряда, обусловленного кислотными или щелочными свойствами.
Когда сравнили «отпечатки пальцев» нормального и серповидного гемоглобинов, они не совпали только в одном месте. Оно соответствовало более кислой среде в нормальном гемоглобине. Полинг оказался прав. Теперь оставалось самое главное и интересное: установить, какие именно остатки не совпадают. Оказалось, что «более кислая» глутаминовая кислота нормального гемоглобина была замещёна валином в серповидном. Так установили причину этой молекулярной, как назвал её Полинг, болезни.
Сегодня открыты ещё сотни молекулярных болезней, из которых многие вызваны «опечатками» в молекуле гемоглобина. Такие болезни крови называют гемоглобинопатии. В настоящее время известно около 400 аномалий гемоглобина. Почему даже единственная замена среди множества аминокислот приводит к печальным последствиям? Все дело в строении аминокислотных остатков, которое обусловливает их свойства. В последнее время удалось разобраться в механизме некоторых молекулярных болезней. Вот как объясняется, например, одна из гемоглобинопатии, при которой в аномальной молекуле гемоглобина два атома железа из четырёх легко окисляются до трёхвалентных. При этом кровь больных имеет в 2 раза меньшую кислородную ёмкость, чем нормальная..
Устойчивость двухвалентного состояния железа в молекуле гемоглобина обеспечивается расположенным рядом аминокислотным остатком – гистидином. В его состав входит имидазольное кольцо (такое же как и пиррольное кольцо, но с лишним атомом азота в одном из углов), способное создавать определённое электрическое поле, которое прочно удерживает электроны атома железа. Если же происходит «опечатка» в наследственном механизме – и место гистидина занимает чужой аминокислотный остаток– тирозин, то картина резко меняется. Тирозин тоже имеет кольцо, но совсем другое – оксибензольное, которое уже не обладает определённой электрической активностью и не может уберечь атом железа от окисления. Он при этом переходит в трёхвалентное состояние и теряет способность переносить кислород.
Конечно, сегодня ещё рано говорить об изгнании «беса» наследственности, путающего генетические карты нашего организма; но бороться с некоторыми гемоглобинопатиями уже можно, тем более зная породившие их причины. Лайнус Полинг, например, ратует за применение витамина С. Это хороший восстановитель – он может способствовать переходу трёхвалентного железа дефектного гемоглобина в двухвалентное.
