Текст книги "Избегайте занудства"

Глава 13. Навыки, необходимые для общения с университетскими коллегами

К середине 1960-х направление исследований, которые проводились на четвертом этаже в моей лаборатории и в лаборатории Уолли, все больше устремлялось в сторону проблемы регуляции работы генов специфическими переключателями – некоторыми факторами среды. Мы были поглощены концепциями, которые в последнее десятилетие создавались в Институте Пастера в Париже. Работавшие там Жак Моно и Франсуа Жакоб мастерски использовали генетический анализ бактерии Е. coli для изучения механизма, позволяющего в среде, содержащей молочный сахар лактозу преимущественно, синтезировать расщепляющий лактозу фермент β-галактозидазу. Они показали, что существует некий лактозный «репрессор», присутствие которого снижает скорость синтеза β-галактозидазы. Полученные ими результаты заставляли предположить, что свободные молекулы лактозного репрессора связываются с одним или несколькими регуляторными участками гена β-галактозидазы, тем самым не позволяя синтезирующему РНК ферменту РНК-полимеразе в дальнейшем связываться с этим геном. В работе, опубликованной в материалах симпозиума в Колд-Спринг-Харбор 1961 года, Жакоб и Моно высказали предположение, что лактозный репрессор представляет собой молекулу РНК. По-прежнему оставалось спорным, были ли правы они или те, кто подозревал, что это белок.

Главная цель Уолли в 1965 году состояла в том, чтобы выделить лактозный репрессор. Поскольку в каждой бактериальной клетке было, судя по всему, лишь несколько молекул этого вещества, эта задача была не для малодушных. Двумя годами раньше Уолли провел несколько месяцев в безуспешных поисках лактозного репрессора, исходя из того, что он должен специфически связываться с веществами-индукторами, стимулирующими синтез β-галактозидазы. Почувствовав, что ничего не получается, он переключился на совместные эксперименты с Джулианом Дэвисом и Луиджи Горини, позволившие показать, что стрептомицин вызывает ошибки считывания генетического кода, чем, возможно, и объяснялось губительное воздействие этого сильного антибиотика на бактерии.

Найти лактозный репрессор стремился также немецкий биохимик Бенно Мюллер-Хилл, который был на год младше Уолли. Бенно вырос в семье с либеральными политическими взглядами и «полевел», когда был студентом-химиком и попал в среду немецких студентов-социалистов, открыв для себя, что многие из преподавателей Мюнхенского университета были некогда сторонниками нацистов, причем никого из руководства это, казалось, не беспокоило. Впоследствии Бенно работал над диссертацией в своем родном городе Фрайбурге в лаборатории специалиста по углеводам Курта Валленфельса. Там он освоил основы химии белка, изучая β-галактозидазу. Впоследствии, осенью 1963 года, Бенно получил ставку постдока в лаборатории Говарда Рикенберга в Индианском университете, куда он привез из лаборатории Валленфельса образцы гликозидов, чтобы изучать их способность специфически индуцировать синтез β-галактозидазы.

В Блумингтоне Бенно никогда не чувствовал себя уютно – ни как немец среди многочисленных работавших там биохимиков-евреев, ни как левый среди американцев, удивлявших его своими параноидальными идеями о коммунистах в их среде. Но проведенные там эксперименты, результаты которых дали ему достаточно материала для доклада на Международном биохимическом конгрессе в Нью-Йорке в августе 1964 года, вполне вознаградили его за эти трудности с общением. К тому времени он хотел обратиться к изучению лактозного репрессора и подошел ко мне после моего доклада, чтобы узнать, не возьму ли я его в свою гарвардскую лабораторию. Объяснив, что ему нужно обратиться не ко мне, а к Гилберту, я убедил его посетить Гарвард, как только Уолли вернется из своей продолжительной поездки в Англию. Когда они встретились, Уолли сразу увидел в Бенно как раз того сотрудника, что был ему нужен, и предложил ему исследовательскую ставку, которую тот мог получить, как только, не нарушая приличий, покинет лабораторию Говарда Рикенберга.

В Блумингтоне Бенно научился генетическим манипуляциям с Е. coli. Вскоре после прихода в Гарвард он умело применил эти недавно приобретенные навыки, чтобы показать, что лактозный репрессор действительно представляет собой белок, а не молекулу РНК. Используя химические мутагены, он получил почти двести мутантов Е. coli, синтезировавших β-галактозидазу в отсутствие каких бы то ни было индукторов. У двух из этих двухсот мутация представляла собой изменение исходного кодона на "нонсенс-кодон", что приводило к преждевременной терминации синтеза полипептидной цепочки. Если бы репрессор представлял собой РНК, такого класса мутантов не должно было существовать. Первый черновой вариант рукописи Бенно не открывал всей простоты и изящества поставленного им эксперимента. Сказав ему, что его рукопись написана в тяжелом тевтонском стиле, я переписал ее, и в октябре она была отдана в Journal of Molecular Biology. Как один из редакторов этого журнала, я знал, что она будет быстро опубликована.

Хотя и Бенно, и Уолли в своих предшествующих независимых исследованиях не смогли выделить лак-репрессор через его связывание с сильными индукторами β-галактозидазы, по-прежнему единственный подход у них в распоряжении был основан на этом свойстве peripeccopa. Чтобы увеличить шансы на успех, Бенно вновь обратился к генетике бактерий, получив мутантный репрессор, обладавший повышенным сродством к веществу-индуктору изопропил-(3-0-1-тиогалак-топиранозиду (ИПТГ). Выращивая мутантные клетки Е. coli при очень низких концентрациях ИПТГ, можно было получить намного более эффективный репрессор. Чтобы удвоить количество репрессора в бактериях, Бенно получил из исходного мутанта нового, диплоидного, содержавшего соответствующий ген в двух экземплярах. Однако сами по себе эти генетические уловки еще не позволяли засечь лак-репрессор в бесклеточном экстракте. Успех пришел только благодаря разработке методики разделения веществ, которая давала образцы белков, богатые лак-репрессором. Первые положительные результаты были получены в мае 1966 года, но они были весьма ненадежны. В бактериальных экстрактах, содержащих репрессор, оказывалось лишь на 4% больше помеченного радиоактивной меткой ИПТГ, чем в окружающем, лишенном репрессора растворе. Вскоре более совершенные методы фракционирования позволили получить частично очищенный образец, собиравший ИПТГ в полупроницаемом диализном мешке в концентрации, почти вдвое превышавшей ту, что наблюдалась снаружи. На эти обогащенные экстракты не действовали ферменты, расщепляющие ДНК и РНК. Ферменты протеиназы, расщепляющие белок, напротив, полностью останавливали связывание ИПТГ, подтверждая вывод генетических исследований Бенно, что репрессор представляет собой белок.

До этого у Уолли и Бенно была вполне реальная перспектива оказаться не первыми, кто опишет молекулярную природу одного из репрессоров. На пятом этаже работал двадцатишестилетний Марк Пташне, который лихорадочно пытался выделить репрессор фага λ. Когда фаг пребывает в виде неактивного профага на хромосоме Е. coli, этот репрессор блокирует работу всех генов фага λ, кроме одного. Единственный ген фага λ, который при этом работает, есть ген, кодирующий сам репрессор. Хотя о его существовании стало известно благодаря изящным генетическим экспериментам, постаатенным в Институте Пастера, никто в Париже не смог предложить какого-либо реального подхода для выяснения его молекулярных свойств.

Марк пришел в Гарвард осенью 1960 года, чтобы работать над диссертацией доктора философии под руководством Мэтта Мезельсона. Такими же неотъемлемыми составляющими его натуры, как стремление заниматься передовыми научными исследованиями, были его кожаная мотоциклетная куртка, скрипка и клюшки для гольфа. Когда Марк учился в средней школе, он проводил летние каникулы в Миннесотском университете, где работал в лаборатории нейрофизиологии, которой руководил друг его семьи, человек левых убеждений. Он предпочел Гарварду Рид-колледж, где большое внимание уделялось проблемам образования, перешел с философии на биологию, а в течение лета перед последним годом в колледже работал в Орегонском университете. Там Фрэнк Сталь посоветовал ему пойти учиться дальше в Гарвард, чтобы работать под руководством Мэтта Мезельсона. Марк уже знал, что следующей большой задачей в мире изучения бактериофагов было выделение репрессора фага λ. Но эта цель была слишком рискованной для ранней диссертации доктора философии, поэтому Марк взялся за довольно рутинный генетический анализ фага λ. Когда его экспериментальная работа по теме диссертации подходила к концу, Пол Доути и я приложили все усилия, чтобы Марка взяли на три года в Гарвардское общество стипендиатов. Это дало бы ему шанс разобраться с репрессором фага λ. Его кандидатура прошла на ура, поскольку Василий Леонтьев, новый глава Общества стипендиатов, видел в Марке подходящего человека для участия в разговорах за ужинами общества по понедельникам. Он стал младшим стипендиатом в июле 1965 года. В августе того же года я подал в Национальный научный фонд заявку на грант в размере 55 000 долларов, чтобы из этих денег выплачивать Марку зарплату и оплачивать расходы на его лабораторные исследования в течение трех лет, в том числе зарплату лаборанту в размере 5000 в год. Это финансирование позволило бы ему работать независимо от его руководителя, Мэтта Мезельсона, который к тому времени совершенно отчаялся от стиля работы Марка, нередко небрежного. При этом в моей заявке отмечалось, что Марк будет использовать для выявления репрессора фага λ технологию ДНК-РНК-гибридизации, которая начала давать сумбурные результаты еще до того, как грант был получен. О том, как РНК-полимераза считывает гены в бесклеточных экстрактах, известно было недостаточно.

Марк вскоре изменил свою стратегию. Он начал искать различия между белками, синтезируемыми после того, как сильно облученных бактерий заражают разными типами фага λ. По оценке Марка, синтез репрессора должен был составлять только 0,01% от всего синтеза белка в клетках, являющихся носителями профагов X. Чтобы сделать редкие молекулы репрессора заметными, ему нужно было радикально сократить синтез большинства бактериальных белков, а также ингибировать синтез всех специфических белков фага λ, кроме репрессора. Он решил попробовать урезать постоянный синтез клеточных белков, облучив бактериальные клетки, предназначенные для заражения вирусом, сильными дозами ультрафиолетового света.

Эксперименты Марка были спланированы изящно, но добиться, чтобы они сработали, было не так-то просто. Хотя на ранних этапах казалось, что все идет успешно, затем последовали жестокие неудачи с попытками выявить помеченный радиоактивной меткой белок. Летом 1966 года почти все эксперименты Марка проваливались, в то время как Уолли и Бенно получали новые и новые подтверждения того, что обнаруженный ими белок действительно был лак-репрессором.

Марк Пташне бросает мяч в ходе игры в софтбол на симпозиуме в Колп-Спринг-Харбор 1968 года.

С Уолли Гилбертом и моими студентами, аспирантами и постдоками на носороге перед отделением биологии.

По счастью, жизнь Марка стала неизмеримо лучше благодаря непредвиденному появлению у нас моей бывшей ученицы из Рэдклиффа, Нэнси Хейвен Доу.

Нэнси интересовалась репрессорами с тех самых пор, когда узнала о них на моих лекциях по углубленному курсу биологии весной 1963 года. До того времени она представляла себе свою будущую жизнь в роли жены какого-нибудь светского человека, с большой вероятностью – Брука Хопкинса, выпускника Гарварда 1963 года, с которым она познакомилась, когда он учился на первом курсе, и "условную помолвку" с которым сохранила в течение пяти лет. Когда Нэнси училась на последнем курсе колледжа, я обратил внимание на живость ее интеллекта и всячески советовал ей продолжить обучение. Ставя для нее высокую планку, я написал президенту Рокфеллеровского университета, Детлеву Бронку, рекомендуя принять ее в магистратуру. Но Бронк, вероятно в связи с тем, что Нэнси так недавно пришла в науку, не клюнул на это. Вместо Рокфеллеровского университета Нэнси попала в Иель, в чем ей, возможно, помогло мое рекомендательное письмо – в нем я характеризовал ее как способную ученицу, которой к тому же повезло быть жизнерадостной и симпатичной.

В свой первый год в Нью-Хейвене Нэнси взяла на себя обычную полную нагрузку из четырех курсов и на осенний, и на весенний семестр. Она освоила волновое уравнение Шрёдингера, а также множество фактов из области химии, знанием которых ей, если повезет, никогда не предстояло воспользоваться. Пять твердых отличных оценок не оставляли Алану Гарену иного выбора, кроме как взять ее в свою молекулярно-генетическую лабораторию, где она хотела приступить к изучению репрессора. Однако, лучше познакомившись с Аланом, она узнала, что он немногословен, чрезмерно осторожен и не может уделять много времени своим подопечным. Он сказал ей, что не годится для исследований репрессора, что это слишком сложная проблема для человека старше тридцати пяти. Предложенная ей скучная альтернатива не смогла бы увлечь и поддержать Нэнси в ее занятии наукой. Она осталась тверда в своем стремлении не сопротивляться посредственности, о чем в начале марта 1966 года написала мне письмо. К концу весны жизнь в Нью-Хейвене стала невыносимой, и Нэнси сбежала оттуда вместе с другой такой же разочарованной начинающей исследовательницей на остров Миконос.

Вернувшись в Штаты, она опасалась, что, оставшись в Йеле, обречет себя на работу в лаборатории Билла Конигсберга со скучным-скучным гемоглобином. В августе она написала мне письмо, предлагая свои услуги в лаборатории Марка Пташне в качестве лаборантки. Там ее одержимость идеей работать с репрессорами, начавшаяся три с половиной года назад, реализовалась. Всего за несколько дней до этого она посетила Гарвард, где обнаружила, что Марк так сильно нуждается в разумном помощнике, что готов простить ей даже то, что Нэнси на шесть дюймов его выше. Нэнси же находила, что изучать репрессор в качестве лаборантки намного лучше, чем быть студенткой и не изучать репрессор. Желая узнать мое мнение о возможности для нее этой новой карьеры, она ясно дала мне понять, что никогда не была и никогда не будет влюблена в Марка Пташне. Успокоенный этим, я дал ей свое благословение. И все же оказалось, что Нэнси была тем самым тонизирующим средством, в котором нуждался Марк. В присутствии такого методичного и дотошного человека, как она, гарантировавшего, что Марк не забудет ни об одном существенном для эксперимента реагенте, он смог последовательно выделить репрессор фага λ, и начать исследовать его молекулярные свойства. Марк и Нэнси вскоре показали, что репрессор представляет собой белок с молекулярной массой около 30 000. Хотя Нэнси поначалу верила, что Марк сможет выиграть гонку за репрессором, ему было известно обратное. Уолли и Бенно уже готовили статью, в то время как Марку, судя по всему, требовалось еще по крайней мере шесть недель лабораторной работы, прежде чем начать писать. Бенно регулярно поднимался на пятый этаж, чтобы проверить, как там идут дела, что немало раздражало Нэнси. Она думала, что он приходит, прежде всего, чтобы позлорадствовать. Но, видя, как Марк всегда вежливо принимает Бенно, Нэнси научилась вести себя столь же уверенно и учтиво. Что же касается Уолли, то Марк относился к нему с таким пиететом, что проиграть ему не было обидно. Уважение, с которым Нэнси относилась к Марку, было не менее очевидным: каждый день она ходила на Дивинити-авеню к машине, из которой продавали сэндвичи, чтобы купить ему обед – яичный салат и сэндвич, а иногда и шоколадный эклер для подкрепления его душевных сил.

Статья Уолли и Бенно "Выделение лак-репрессора" была отдана в Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS) 24 октября 1966 года, как раз вовремя, чтобы выйти в декабрьском номере. Если бы я задержал предстаатение этой работы в журнал, чтобы дать Марку возможность завершить эксперименты, нужные для его собственной статьи, то дата публикации открытия Уолли и Бенно относилась бы уже к следующему году. Марк предпочел бы, чтобы я так и сделал, но я убеждал его, что никто не станет считать его работу менее важной из-за того, что она будет опубликована второй. 27 декабря статья "Выделение репрессора фага λ" ушла в PNAS и была опубликована в февральском номере 1967 года. Марк торжественно объявил о выделенном им репрессоре фага X на семинаре в чайной комнате нашей лаборатории за месяц до выхода его статьи. Комната была набита до отказа, и Марк в момент своего торжества ("Я все это сделал сам!") так и не поблагодарил Нэнси за ее ключевую роль в своем успехе. После семинара я строго отчитал его за это. Он сразу понял, что был чрезмерно поглощен самим собой, и в тот же вечер позвал Нэнси, чтобы извиниться, а позже прислал ей цветы.