Текст книги "Секретные результаты опытов клонирования. Сколько их среди нас?"

Автор книги: Ирина Зайцева

сообщить о нарушении

Текущая страница: 3 (всего у книги 12 страниц) [доступный отрывок для чтения: 5 страниц]

Партеногенез

В данном разделе мы расскажем о партеногенезе у животных. Размножение растений путем партеногенеза меркнет перед их способностью регенерировать генетически идентичный растительный организм из практически любой клетки собственного тела. Это является примером соматического клонирования и бесполой репродукции (если для регенерации взята не половая клетка). В данном случае нередко возникает путаница, поскольку партеногенез часто относят к бесполому размножению.

Даже в старой русской литературе по зоологии партеногенез был отнесен к половой репродукции. И это неудивительно, поскольку развитие в данном случае происходит из яйца, являющегося специализированной женской половой клеткой. Все так же, как и в случае нормального полового размножения, с той лишь разницей, что исключается участие мужской гаметы-сперматозоида.

Общие представления о партеногенезе

Итак, чем же интересно в настоящее время партеногенетическое развитие? Должно быть тем, что данный метод предусматривает развитие яйца без оплодотворения, то есть слияния женского и мужского ядер, ведущего к образованию зиготы. Для начала рассмотрим процессы, происходящие в яйце, и определим суть партеногенеза.

Запуск процессов в яйце называется активацией. Активация может быть спровоцирована различными агентами. Один из них, наиболее привычный для нас – сперматозоид. Без активации яйца не происходит развития, без сперматозоида оно возможно как в естественных, так и в искусственно созданных условиях.

Сложность в данном вопросе возникает в основном по той причине, что мужская гамета считается неотъемлемым пусковым агентом развития. На практике участие сперматозоида в запуске развития связано со многими другими факторами. Без них сперматозоид не может выполнить свою функцию даже будучи помещенным внутрь яйца, например, с помощью микропипетки.

Активация яйца представляет собой сложный процесс со множеством нюансов и тонкостей. Он сложен не только потому, что состоит из множества биохимических процессов. Основная сложность заключается в его протекании во времени и пространстве, больше очевидном при нормальной активации посредством оплодотворения. Сперматозоид до встречи с яйцом должен пройти так называемую ступенчатую активацию. Это необходимо для того, чтобы мог произойти контакт с рецепторами плазматической мембраны яйца. Следствием данного взаимодействия является множество реакций внутри яйца, завершающихся слиянием яйца со сперматозоидом и образованием ядра зиготы.

В случае отсутствия оплодотворения сперматозоиду вместе с вышеописанной ступенчатой активацией в процессе взаимодействия с яйцом остается только его активирующая функция. В данном случае речь идет о типе партеногенеза, который называется гиногенезом. Суть процесса можно объяснить на примере серебристого карася. Его икринки могут быть осеменены самцами других видов рыб. Чужие сперматозоиды проникают в яйцо карася, активизируют его, но вскоре резорбируются, не принося в женское ядро наследственного материала. Осеменение, то есть процесс проникновения спермия в яйцо, и активация клетки имеют место, однако оплодотворение в данном случае не происодит, поскольку нет слияния женского и мужского ядер.

Его нет и при другом варианте партеногенетического осеменения – андрогенезе. Его можно наблюдать в тех случаях, когда развитие протекает на основе ядра сперматозоида, а женское ядро выведено из развития тем или иным образом. Если та же операция выполняется с фрагментом яйца, развитие называется мерогенезом (мерогонией)….

Всемирно известные создатели овцы Долли первыми в Великобритании получили официальное разрешение на создание стволовых клеток из оплодотворенных яйцеклеток человека. Созданные исследователями клетки планируется использовать для изучения врожденных заболеваний и испытаний новых лекарственных препаратов. Метод получения стволовых клеток теоретически может быть использован для клонирования человека, однако это запрещено законами Великобритании.

Следует затронуть вопрос о том, что происходит в случае перехода какого-либо вида животных от обоеполого к однополому размножению в отсутствие осеменения. Не вызывает сомнений, что потомство оставят лишь одиночные женские особи, у которых имеется в силу изменчивости способность к полному партеногенезу. Неотъемлемым моментом нового способа полового размножения станет активация яйца отличным от сперматозоида фактором. Это может быть один из компонентов предактивационного процесса, который обеспечивает эффективность активации яйца сперматозоидом до внезапного исчезновения самцов из окружающей среды.

Однако перечисленных моментов недостаточно для дальнейшего развития. В активированной яйцеклетке с ядерного аппарата снимается блок, который устанавливается на заключительном этапе оогенеза в процессе созревания. В большинстве случаев деблокирование ядерного аппарата отождествляют с процессом активации.

Однако оно составляет только малую часть всех изменений, происходящих в процессе активации. Происходит возобновление процесса мейоза, остановленного в результате блокирования на определенной, характерной для данного вида стадии. Мейоз приводит к образованию женского пронуклеуса, вмещающего половину хромосомного набора генетического материала матери.

В случае нормального оплодотворения сразу после этого начинается сближение женского и мужского пронуклеусов, которое возможно только в активированном яйце. Оно завершается их слиянием и образованием ядра зиготы.

В случае отсутствия сперматозоида активация яйца может произойти с помощью другого агента. Активационные процессы в яйце, скорее всего, будут отличаться от тех, которые были вызваны мужской гаметой своего вида. Однако развитие может дойти до формирования женского пронуклеуса, который без участия мужского пронуклеуса не способен обеспечить нормальное развитие. В силу этого партеногенетический эмбрион обречен на гибель.

В результате у одних форм женский пронуклеус оказался способным поддерживать все морфогенетические процессы развития с половинным количеством наследственно материала, а в других случаях (они более многочисленны) были обнаружены отклонения в ходе мейоза, приводящие к восстановлению нормального количества хромосом в ядре, с которого начинается дробление, например слияние женского пронуклеуса с одним из полярных телец, образующихся в ходе мейоза.

Следует учитывать функции сперматозоида в естественном варианте оплодотворения. Кроме того, проникая в зрелое яйцо, сперматозоид запускает в нем процесс активации.

Сперматозоид доставляет в яйцо материал, из которого он построен, точнее, его плазматическая мембрана включается в плазматическую мембрану яйца, его ядро преобразуется в мужской пронуклеус. Следует отметить, что центриолярно-аксонемный аппарат и митохондрии могут принимать активное участие в процессе активации.

Таким образом, первая функция сперматозоида независима от второй, в то время как вторая не может начаться и завершиться в случае отсутствия первой. По этой причине развитие может осуществляться без оплодотворения, однако никакое развитие не представляется возможным без активации живой системы.

В настоящее время партеногенез можно рассматривать как стимулируемую способность к развитию любых живых систем, независимо от того, связана ли данная способность с осеменением.

История партеногенеза

Термин «партеногенез» был введен в 1849 г. известным зоологом Ричардом Оуэном. Под партеногенезом Оуэн понимал способность части клеточного потомства первичной оплодотворенной зародышевой клетки (яйца) сохранять достаточную силу для воспроизведения индивидуумов при отсутствии повторения акта оплодотворения. Под это определение подпадало возобновление листьев из почек, явления регенерации (например, восстановление хвоста у ящерицы), а также все варианты бесполого размножения.

Еще до появления термина «партеногенез» в 1737 г. французские естествоиспытатели Реомюр и Бонэ выявили и доказали способность тли к бесполому размножению. В данном случае развитие происходило без участия особей мужского пола. Однако в течение 100 лет после этого открытия ведущей была точка зрения Трамбле, который считал, что в случае девственного размножения осеменение все же однажды произошло. По его мнению, случившегося спаривания было достаточно на несколько поколений вперед. В 1839 г. было доказано, что у живородящей тли, в отличие от яйцекладущих, отсутствует семяприемник. Что касается Реомюра и Бонэ, то они относили данное явление к гермафродитизму без спаривания.

Исследователи рассматривали живородящую тлю как бесполую стадию, обладающую способностью к размножению путем внутреннего зародышеобразования, подобно почкованию у растений. Чтобы подчеркнуть предположительное развитие не из яйца, яичники тли называли зародышниками и утверждали чередование в их жизненном цикле полового и бесполого размножения.

Основная заслуга в определении партеногенеза принадлежит Теодору Эрнсту фон Зибольду. о партеногенезе он писал следующее: «Я понимаю под партеногенезом не размножение посредством кормилицеподобных и личиночных существ, но размножение через действительных самок, то есть особей, обладающих функционирующими женскими половыми органами и могущих без предшествующего спаривания производить неоплодотворенные, способные к развитию яйца». После этого бесполое размножение, чередование поколений и регенерация перестали входить в число явлений, определенных как партеногенез Оуэном.

Следует отметить, что в определении Зибольда говорится о способных к развитию неоплодотворенных яйцах, что предполагает их стимуляцию к развитию каким-либо агентом и побуждает исследователей к поиску универсальных механизмов данной способности к развитию методами экспериментальной биологии. Поиски привели к развитию искусственного партеногенеза сначала у тутового шелко-пряда, а позже у других животных.

В течение долгого времени ученые, занимающиеся тутовым шелкопрядом, не раз сталкивались с вылуплением личинок из яиц, отложенных заведомо неосемененными самками. Следует отметить, что данные наблюдения никогда не принимались во внимание учеными, работавшими с тутовым шелкопрядом. Дело в том, что это явление было настолько редким, что проще было предположить погрешности в наблюдении.

Профессионалы до середины прошлого века проводили объемные исследования разных пород, рас и линий, что позволило сделать вывод о том, что партеногенетическое развитие яиц без видимых причин (спонтанное развитие) происходит крайне редко. В данном случае имеется в виду полное развитие, завершающееся вылуплением личинки (под полным развитием понимается развитие до стадии репродуктивно полноценной бабочки). Если принимать во внимание данное утверждение, частота полного партеногенеза снизится примерно в 2 раза.

У моновольтных шелковичных червей цвет развивающихся яиц уже через сутки начинает изменяться с желтого на розовый, а затем темно-серый. Такая окраска яиц характерна для диапаузы. Для возобновления развития в следующем году яйцам необходимо пройти охлаждение при температуре домашнего холодильника в течение 4 и более месяцев. Изменение окраски объясняется тем, что в ходе развития зародыша под поверхностью яйца образуется однослойная серозная оболочка. Ее клетки постепенно заполняются гранулами пигмента меланина, которые все больше закрывают наполняющий яйцо желток.

Если учитывать величину кладки и процент имеющихся в ней пигментированных яиц, можно с достаточной точностью оценить качество большого количества кладок. Благодаря этому можно отобрать самые лучшие кладки, в которых только единичные яйца по каким-либо причинам не развиваются и остаются желтыми.

Учеными было замечено, что самки, оставленные без самцов, плохо откладывают неосемененную грену. Данный процесс, как правило, растягивается на неделю и более, часть яиц обнаруживается в овариолах погибших бабочек.

Частичная пигментация яиц, не соответствующая норме, не могла остаться незамеченной в течение многих веков. Следует отметить, что такая пигментация приближается к нормальной крайне редко. Именно из таких яиц могут появиться личинки с указанной выше частотой.

Таким образом, любая степень пигментации яйца тутового шелкопряда является признаком начавшегося развития, даже если причины, вызвавшие его, остаются неизвестными. Данный вывод использовал в своих опытах с шелковичными червями в 1886 г. русский зоолог А. А. Тихомиров. Именно он открыл у животных искусственный партеногенез, то есть развитие неоплодотворенного яйца под воздействием искусственного раздражителя.

В своих опытах ученый доказал активирующее действие на неоплодотворенные яйца сильной серной кислоты, электризации посредством трения и горячей воды. Следует отметить, что найденные Тихомировым активаторы во многих случаях существенно повышали процент пигментированных яиц в обработанных пробах. Однако пигментация в большинстве случаев была неполноценной и имела отклонения от нормы. Это соответствовало уродливому развитию зародыша внутри яйца и отсутствию вылупившихся гусениц в обработанной грене.

Заключение Тихомирова сводилось к тому, что практическое применение искусственного партеногенеза не представляется возможным. Само явление он объяснял тем, что искусственный раздражитель заменяет собой раздражение, которое вызывает сперматозоид после проникновения в яйцо. Согласно теории Тихомирова, искусственный партеногенез представляет собой проявление раздражимости – внутреннего свойства всего живого.

Мы уже говорили о двойной функции сперматозоида в процессе оплодотворения. Четкое представление об этой функции было и у Тихомирова, поэтому уродливое развитие искусственно активированного яйца без материала сперматозоида не было для него удивительным. Оно, напротив, подчеркивало необходимость материала мужской гаметы для развития яйца и делало работу с искусственными раздражителями бесперспективной.

Если активирующие агенты способствуют увеличению процента развивающихся яиц по сравнению с контролем, чем же тогда вызвана их активация в самом контроле? Скорее всего, в данном случае играют роль какие-либо неизвестные внешние факторы. Эта точка зрения согласуется с мнением Тихомирова о влиянии на способность яиц к партеногенетическому развитию. Она соответствует и мнению других исследователей о влиянии условий среды, сезона выкормки, качества скармливаемого гусеницам листа шелковицы на уровень спонтанного партеногенеза.

Тихомиров выявил методический прием, который определил успех всех последующих исследований, связанных с партеногенезом тутового шелкопряда. С целью последующей обработки он извлек зрелые яйца из яйцевых трубок девственных бабочек. Таким образом ученый решил 2 проблемы. Во-первых, отпала необходимость ждать, пока неосемененные самки отложат необходимое для опытов количество неоплодотворенной грены. Кроме того, пробы синхронизированных яиц можно отбирать подходящей меркой. Во-вторых, ликвидировались внешние факторы, оказывающие воздействие на яйцо при откладке. Появилась возможность контролировать саму процедуру извлечения.

В 1903 г. Тихомиров прекратил опыты по искусственному партеногенезу. К тому времени они уже широко проводились на других животных объектах, в частности на морских беспозвоночных. Открытие искусственного партеногенеза дало исследователям возможность предположить, что может быть найден способ замены живого сперматозоида хорошо известными физико-химическими факторами.

Это помогло бы выяснить причины, вызывающие развитие яйца при условии его естественного взаимодействия со спермием.

Данный вид взаимодействия приводит в первую очередь к активации яйца. Этот процесс более доступен для наблюдения у морских беспозвоночных, чем на яйцах тутового шелкопряда. По этой причине исследования механизмов естественной и искусственной активации яйца были перенесены с тутового шелкопряда на морского ежа, а затем на земноводных и млекопитающих.

Впоследствии сторонниками физико-химического направления проводились опыты по поиску заменителей действия сперматозоида на яйцо. Например, Жак Леб полагал, что причиной деления клеток является несоответствие между запасными веществами цитоплазмы и хроматиновым веществом ядра. Действие сперматозоида заключается в запуске и ускорении синтеза хроматина ядра из веществ цитоплазмы. Положительный катализатор, привносимый спермием в яйцо, не был обнаружен, поэтому ученые предположили возможность наличия отрицательного катализатора в самом яйце. Этот блок устраняется сперматозоидом в процессе оплодотворения. При естественном партеногенезе этот блок отсутствует, а при искусственном нейтрализуется в результате действия подобранного агента.

Леб постепенно усложнил процедуру активации яиц морского ежа и вывел двухступенчатый метод искусственного партеногенеза. Первый этап состоял в выделении оболочки оплодотворения под действием цитологического агента, в качестве которого использовалась валериановая или масляная кислота. После этого начавшееся развитие доводили до нормы путем непродолжительного действия гипертонического раствора морской соли, вызывающего образование дополнительного центриолярного аппарата (астросферы). Это необходимо для нормального деления яйцеклетки. Используя данный метод, Леб получил большое количество партеногенетических личинок и пришел к выводу, что метод воспроизводит действие сперматозоида.

По мнению Леба, сперматозоид вносит в яйцо как литический, так и корректирующий фактор. Однако нередко результаты исследований не соответствовали представлениям ученого. Помимо этого, литические и корректирующие явления внутри яйца не подлежали толкованию в физико-химических понятиях.

Ученые считали, что основой деления клеток является процесс периодического желатинирования и разжижения цитоплазмы. На этом основании исследователь партеногенеза Ив Деляж решил запустить развитие яйца, вызвав данные изменения искусственным путем, и добился положительных результатов при использовании в качестве раздражающих агентов таннина и аммиака. В результате эксперимента практически все яйца начали развиваться, многие достигли стадии личинки, а некоторые и взрослого состояния.

Известный исследователь процесса оплодотворения Лили полагал, что опыты Деляжа основаны не на теории активации, так как процессы, лежащие в основе явления, только сопровождают активацию, но не являются ее причиной. О теории активации действительно говорить не приходилось, а свойство механизма активации – освобождение от блокирования под действием чередующихся обработок танином и аммиаком – имело место.

Взрослые партеногенетические особи могли быть получены у амфибий путем травматического партеногенеза, при котором яйцо укалывали иглой. Этот метод, открытый Ю. Батайоном, успешно используется и в настоящее время. Автор метода считал, что активация в данном случае состоит из двух этапов. Сначала с помощью укола вызывается сокращение оболочки яйца, что приводит к выделению из него вместе с жидкостью веществ, блокирующих развитие. Затем из клеточных фрагментов, вносимых в цитоплазму в области укола, образуется центриолярный аппарат, осуществляющий первое деление дробления.

Немецкий биолог Теодор Бовери полагал, что активация в данном случае обусловлена тем, что сперматозоид привносит в яйцо необходимый клеточный орган – центросому. Что касается травматического партеногенеза, он может быть рассмотрен как подтверждение центросомной теории Бовери, однако в других случаях партеногенеза привнесение центросомы извне не имеет места. Поэтому считается, что партеногенез доказывает ошибочность теории Бовери.

С течением времени исследования процессов активации ядра распространились и на другие более высокоорганизованные объекты и приобрели характер качественного анализа. Например, на яйцах морской звезды было доказано, что образование оболочки оплодотворения и развитие личинки происходят в различной степени в соответствии с дозой и схемой приложения температурного воздействия. Исследователи заключили, что процесс активации яйца с помощью прогревания зависит от определенного критического изменения в яйце, начинающегося при температуре 29 °C. Данное изменение, ускоряющееся при более высокой температуре, может быть вызвано как разовым, так и множественным приложением температурной дозы.

Часть дозы может быть заменена воздействием других агентов, например слабых кислот. Процесс активации с помощью прогревания изучался в соответствии со степенью зрелости яйца, содержанием в нем кислорода и цианидов. Ученые заключили, что основой активирующего компонента является образование кислоты внутри яйца.

Рядом исследований было доказано, что неидентифицированная кислота образуется в яйце в процессе оплодотворения и при воздействии активаторов искусственного партеногенеза или при хранении в анаэробных условиях. Исследования в области искусственной активации морских беспозвоночных привели к установлению важной роли кальция в активационных процессах. В процессе активации кальций имеет значение как вне яйца, так и внутри него.

Позднее, опираясь на накопленные данные, Пастельс предположил теорию активации, основанную на центральной роли кальция. Согласно данной теории, активация заключается либо в увеличении проницаемости яйца для ионов кальция, либо в изменении равновесия свободного и связанного кальция внутри яйца. После этого Л. Гейльбруном была представлена теория реактивности клетки. Ученый предполагал, что реактивность клетки и активация яйца объясняются переходом кальция из кортекса, где он был связан с протеиновым гелем, внутрь клетки под воздействием различных активаторов, включая сперматозоид, в случае с яйцеклеткой. В результате перемещения кальция происходит уменьшение плотности кортикального слоя (разжижение) и желатинизация нужного слоя ооплазмы. Описанный процесс является важнейшей характеристикой активации….

Доктор Панайотис Завос сообщил о том, что готов вырастить ребенка из замороженного десятиклеточного клонированного эмбриона. Как сообщили источники СМИ, через несколько недель будет проведена имплантация эмбриона суррогатной матери. Для создания клона была использована ДНК 46-летней американки. Манипуляции будет позволено снимать британскому кинематографисту Питеру Уильямсу, который в 1978 г. зафиксировал весь процесс создания первого ребенка «из пробирки».

Было также показано, что лишенное кортекса яйцо не способно к оплодотворению. После этого на внутренней границе кортикального слоя были обнаружены расположенные в виде монослоя кортикальные гранулы. В процессе оплодотворения эти гранулы исчезают за 15–20 секунд. Этот процесс начинается в точке вхождения спермия в яйцо и распространяется под поверхностью яйца. Кортикальную реакцию вызывают следующие партеногенетические агенты: сапонин, толуол, ультрафиолет, укалывание, электрическое воздействие и т. д. Однако перечисленные агенты действуют лишь при условии, что яйцо не было обработано оксалатом и цитратом, связывающими кальций.

Со временем представление о процессе активации яйца усложнилось. В число исследовательских методов начали входить электронная микроскопия, молекулярная биология, оплодотворение и культивирование зародышей и другие.

Что касается генетического периода в изучении искусственного партеногенеза, его начало положил японский исследователь Ю. Сато. Он получил новое партеногенетическое развитие у тутового шелкопряда, неоплодотворенные яйца которого были обработаны соляной кислотой, кроме того, Сато впервые провел цитологический анализ партеногенеза данного типа, который впоследствии получил название мейотического. В исследованиях появляется и генетический анализ. Тутовый шелкопряд оказался очень удобным объектом для изучения.

Первым ученым, выявившим значение партеногенеза в процессе селекции, стал основоположник экспериментальной биологии в России Н. К. Кольцов. Ученый проанализировал возможные комбинации гаплоидных дериватов мейоза при партеногенезе и связал их с гетерозисом и инбридингом.

Фундаментом современных и будущих исследований в области любого партеногенетического исследования в животном мире является исследовательская работа Б. Л. Астаурова и его сотрудников (1932–1974 гг.). Основой исследований стал тщательно разработанный Астауровым метод термической активации неоплодотворенной грены. Данный метод положил начало управлению цитогенетическими процессами раннего развития организма.

Цитологический механизм по методу Астаурова отличается от механизма естественного партеногенеза, функционирующего и в мейотическом партеногенезе, открытом Сато. По этой причине вызывает большой интерес достигнутая возможность искусственного вызывания развития посредством прогревания яйца, предварительно извлеченного из брюшка бабочки. Такой вариант развития, видимо, не наблюдался в истории данного организма, поэтому большинство биологических следствий эксперимента невозможно было предвидеть заранее. Следует отметить, что данные результаты превзошли даже самые смелые ожидания исследователей.

Открытый механизм искусственного партеногенеза относится к амейотическому типу. Он сопровождается образованием исключительно женского потомства, в то время как в исследованиях Сато и в случае спонтанного партеногенеза потомство в большинстве случаев оказывается мужского пола.

Название «термопартеногенез» отражает основную особенность его цитологического механизма (подавление редукции хромосом в женском мейозе). Вследствие этого он перестает быть мейозом и посредством оставшегося эквационного деления преобразуется в митоз. По этой причине обнаруживается не 4 ядерных гаплоидных производных мейоза, а лишь 2 дочерних диплоидных ядра митотического деления. Одно из этих ядер является женским пронуклеусом, а другое – единственным направительным тельцем.

Следует отметить, что это тельце может не отходить в периферический слой ооплазмы, поскольку оно включается в начинающийся процесс ядерного деления, соответствующий дроблению, например яйца морского ежа.

К этому можно добавить установленное в 1911 г. отсутствие кроссинговера в женском мейозе тутового шелкопряда. Таким образом, можно сделать вывод, что дочерние ядра, образующиеся в результате оставшегося от мейоза эквационного деления, должны содержать материнский генотип. Партеногенетическое потомство одной самки должно быть клоном, иными словами, совокупностью генетически идентичных особей.

Позднее Астауровым было осуществлено искусственное клонирование животных, которое принято называть партеногенетическим клонированием. Первое, на что обращалось особое внимание, – изогенность полученных особей клона между собой. Совпадали пол, рисунок покрова, цвет гемолимфы, цвет кокона, грены и повторялись соответствующие признаки самки-оригинала.

Количество клонов увеличивалось в результате введения в работу различных рас, пород, линий шелковичного червя. Астауров разработал схему селекции, на основе которой с каждым геном получали клоны с более высоким процентом полного партеногенеза.